兔肺小動脈內(nèi)皮原代細(xì)胞公司出售的產(chǎn)品：小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞 牛細(xì)胞 英文名稱： MDBK (NBL-1) 人支持細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒 人支持細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠肺血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基 100mL 上皮細(xì)胞 人原代肺大靜脈內(nèi)皮細(xì)胞

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細(xì)胞屬性：

方法簡介

實驗室分離的兔肺小動脈內(nèi)皮采用-膠原酶聯(lián)合消化法結(jié)合差速貼壁法,、并通過內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。

質(zhì)量檢測

實驗室分離的兔肺小動脈內(nèi)皮經(jīng)CD31免疫熒光鑒定,，純度可達90%以上,，且不含有HIV-1、HBV,、HCV,、支原體、細(xì)菌,、酵母和真菌等,。

 

細(xì)胞簡介：

兔肺小動脈內(nèi)皮細(xì)胞分離自肺小動脈組織；肺動脈干是短而粗的動脈,，自右心室的動脈圓錐起始,，向左后上方斜升，先在升主動脈根部的前面,，繼而至其左側(cè),，至主動脈弓的下方,，約在第5胸椎高度,，分為左、右肺動脈,。左肺動脈較短,，橫行向左，經(jīng)左主支氣管前方至左肺門,，分兩支進入左肺的上,、下葉。右肺動脈較長,，橫行向右,，經(jīng)主動脈升部和上腔靜脈的后方達右肺門，分3支進入右肺上,、中,、下葉。左,、右肺動脈的各分支在肺實質(zhì)內(nèi)又反復(fù)分支,，與支氣管的分支伴行，后達肺泡壁,，形成稠密的毛細(xì)血管網(wǎng),。肺動脈輸送的是含二氧化碳較多的靜脈血。在肺動脈干分叉處稍左側(cè)與主動脈弓下緣之間有一結(jié)締組織索,，稱動脈韌帶,。管徑在0.3-1mm之間，為小動脈（small-artery）,，小動脈包括粗細(xì)不等的幾級分支,，也屬肌性動脈,。較大的小動脈，內(nèi)膜有明顯的內(nèi)彈性膜,，中膜有幾層平滑肌,，外膜厚度與中膜相近，一般沒有外彈性膜,?？趶皆?span>1mm以下的動脈，管壁有完整的平滑肌層及少量的彈性纖維和膠質(zhì)纖維,。小動脈是決定周圍循環(huán)阻力大小的主要因素,，也是調(diào)節(jié)微循環(huán)灌注量的“總開關(guān)"。典型的小動脈,，其管壁的厚度與管徑相比約為1∶2,。中膜的肌層相對比其他動脈為厚，當(dāng)平滑肌在支配下強力收縮時,，其管腔可以閉塞,，而使血液不能流入它所分布的毛細(xì)血管內(nèi)，從而增加了周圍血液循環(huán)的阻力,。如果有許多小動脈同時收縮,，可使血壓顯著上升。反之,，當(dāng)小動脈的平滑肌舒張時,，則可使大量的血液流入毛細(xì)血管，外周阻力明顯下降,，血壓降低,。終末小動脈(terminal arteri-ole)的口徑為20-30μm；后小動脈(metar-teriole),，又稱毛細(xì)血管前小動脈(precapil-lary arteriole)的口徑為12-15μm,。管壁內(nèi)均有較稀疏的平滑肌，在毛細(xì)血管前小動脈分支的起始部分,，管壁平滑肌成分增厚,，叫做毛細(xì)血管前括約肌(precapillary sphinc-ter)，其收縮或舒張,，可調(diào)節(jié)真毛細(xì)血管的血流量,，是調(diào)節(jié)微循環(huán)灌注量的“分開關(guān)"。支配小動脈平滑肌的交感纖維,，可延伸到終末小動脈和后小動脈的平滑肌細(xì)胞,。在毛細(xì)血管前括約肌上交感纖維特別豐富。肺小動脈內(nèi)皮細(xì)胞呈單層多角形鋪路石狀分布，該細(xì)胞在維持血管內(nèi)外的動態(tài)平衡,、合成和分泌細(xì)胞因子和介質(zhì),、維持凝血和纖溶的動態(tài)平衡中起重要作用。

培養(yǎng)信息：

包被條件：PLL（0.1mg/ml）,，明膠（0.1%）

培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基,，含FBS、EGF,、bFGF,、IGF、VEGF,、Heparin,、Hydrocortisone、Penicillin,、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：貼壁

細(xì)胞形態(tài)：內(nèi)皮細(xì)胞樣

傳代特性：可傳2-3代

消化液：0.25%

培養(yǎng)條件：氣相：空氣,，95%；CO2,，5%

兔肺小動脈內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)周期有限,；建議使用配套的專用生長培養(yǎng)基及正確的操作方法來培養(yǎng)，以此保證該細(xì)胞的佳培養(yǎng)狀態(tài),。

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1,、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿,，蓋好放入培養(yǎng)箱消化,；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞,，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁,，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止,；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中,，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集,，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中,。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右,，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻,。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻,，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中,，補加適量培養(yǎng)基。

3,、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時進行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后,，顯微鏡下觀察細(xì)胞,，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞,；

④將凍存管放入程序降溫盒,，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存,。

公司產(chǎn)品：

操作步驟：

1.將無菌的蓋玻片置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中進行細(xì)胞爬片,，待細(xì)胞長至80%時取出爬片,。

2. 用PBS浸洗爬片3次，4%的多聚甲醛固定爬片15min,，再次用PBS浸洗玻片3次,，每次3min。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min,，使細(xì)胞通透,。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過氧化氫）,，PBS沖洗3次,，每次3min。

5. 封閉血清室溫孵育20min,，PBS沖洗3次,，每次3min,。

6. 細(xì)胞特異性一抗孵育：按照抗體說明書稀釋比例稀釋好一抗，滴加在爬片上,，于4°C濕盒中孵育一夜,，PBS沖洗3次，每次3min,。

7. 二抗孵育：選與一抗對應(yīng)的二抗,，按比例稀釋后滴加在爬片上，37°C濕盒中孵育30min,，PBS沖洗3次,，每次3min。

8. 將爬片周圍水漬吸干,，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液,，顯微鏡下觀察，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色的陽性信號時用蒸餾水沖洗終止顯色,。

9. 復(fù)染：用Harris蘇木素復(fù)染30s~1min,，水洗后用1%的鹽酸酒精分化，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍(lán),。

10. 封片：將中性樹膠滴在爬片一側(cè),，再用蓋玻片蓋上，先放平蓋玻片一側(cè)再輕輕放下另一側(cè),，以免產(chǎn)生氣泡,，封好的爬片平放置于通風(fēng)廚中晾干。

11. 鏡檢觀察,。