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細胞屬性：

方法簡介

實驗室分離的兔表皮角質形成層細胞先蛋白酶消化、后-膠原酶混合消化法制備而來,，細胞總量約為5×10?cells/瓶,。

質量檢測

實驗室分離的兔表皮角質形成經PCK免疫熒光鑒定,，純度可達90%以上,，且不含有HIV-1、HBV,、HCV,、支原體、細菌、酵母和真菌等,。

細胞簡介：

兔表皮角質形成細胞分離自皮膚組織,；表皮位于動物皮膚的外層，由胚胎時期外胚層形成,，具有抗摩擦和抗損傷的作用,。表皮是皮膚的淺層結構，由復層扁平上皮構成,。從基底層到表面可分為五層,，即基底層、棘層,、顆粒層,、透明層和角質層。表皮角質形成細胞是一種能合成角質蛋白的上皮細胞,，此類細胞為表皮的主體,，由表皮深層始逐漸增殖、分化,，并在成為角化的角質細胞中,，細胞核與細胞器消失，細胞亦失去生理功能而脫落,。未脫落部分對機體尚有保護作用,，故不必在洗擦身體時用力搓擦，使其過早脫失,。表皮角質形成細胞主要分布于表皮基底層,，在上皮程序性死亡后，細胞產生角化并移向表皮,。體外培養(yǎng)的表皮角化細胞容易導致終末分化,，不能充分增殖。角質形成細胞終產生角質蛋白,，在其向角質細胞演變過程中,，一般可以分為四層，即基底層,、棘層,、顆粒層以及角質層。有人把前三層或前二層稱為生發(fā)層或馬爾匹基層,。此外,，在某些部位，特別在掌跖部位,，角質層下方還可見到透明層,。

培養(yǎng)信息：

包被條件：鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培養(yǎng)基：含FBS,、生長添加劑、Penicillin,、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：貼壁

細胞形態(tài)：上皮細胞樣

傳代特性：可傳1-2代

消化液：0.25%

培養(yǎng)條件：氣相：空氣,，95%；CO2,，5%

兔表皮角質形成細胞體外培養(yǎng)周期有限,；建議使用配套的專用生長培養(yǎng)基及正確的操作方法來培養(yǎng)，以此保證該細胞的佳培養(yǎng)狀態(tài),。

細胞培養(yǎng)方法：

1,、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,；

②加入2ml0.25%（T25瓶）,，使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化,；

③1-2min后,，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落,，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；若細胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止,；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中,，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基,；

⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中,。

2,、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右,，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻,。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻,，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中,，補加適量培養(yǎng)基。

3,、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后,，顯微鏡下觀察細胞,，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞,；

④將凍存管放入程序降溫盒,，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存,。

操作步驟：

1.將無菌的蓋玻片置于細胞培養(yǎng)皿中,，將細胞懸液接種于培養(yǎng)皿中進行細胞爬片，待細胞長至80%時取出爬片,。

2. 用PBS浸洗爬片3次,，4%的多聚甲醛固定爬片15min，再次用PBS浸洗玻片3次,，每次3min,。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min，使細胞通透,。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內源性過氧化物酶,，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過氧化氫），PBS沖洗3次,，每次3min,。

5. 封閉血清室溫孵育20min，PBS沖洗3次,，每次3min,。

6. 細胞特異性一抗孵育：按照抗體說明書稀釋比例稀釋好一抗，滴加在爬片上,，于4°C濕盒中孵育一夜,，PBS沖洗3次，每次3min,。

7. 二抗孵育：選與一抗對應的二抗,，按比例稀釋后滴加在爬片上，37°C濕盒中孵育30min,，PBS沖洗3次,，每次3min。

8. 將爬片周圍水漬吸干,，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液,，顯微鏡下觀察，當出現棕黃色或棕褐色的陽性信號時用蒸餾水沖洗終止顯色,。

9. 復染：用Harris蘇木素復染30s~1min,，水洗后用1%的鹽酸酒精分化,，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍。

10. 封片：將中性樹膠滴在爬片一側,，再用蓋玻片蓋上,，先放平蓋玻片一側再輕輕放下另一側，以免產生氣泡,，封好的爬片平放置于通風廚中晾干,。

11. 鏡檢觀察。

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