人腎臟微血管內(nèi)皮原代細(xì)胞公司出售的產(chǎn)品：人原代腦靜脈血管平滑肌細(xì)胞 人黑色素瘤細(xì)胞 英文名稱： M14 BC3H1 小鼠腦瘤細(xì)胞 1ml/T75 MDA-MB-231, 人癌細(xì)胞 EA.hy926 人臍靜脈細(xì)胞融合細(xì)胞 小鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞

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細(xì)胞屬性：

方法簡(jiǎn)介

實(shí)驗(yàn)室分離的人腎臟微血管內(nèi)皮采用膠原酶消化,，結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來(lái)，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶,。

質(zhì)量檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)室分離的人腎臟微血管內(nèi)皮經(jīng)CD31免疫熒光鑒定,，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1,、HBV,、HCV、支原體,、細(xì)菌、酵母和真菌等,。

 

細(xì)胞簡(jiǎn)介：

人腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞分離自腎臟,；腎臟是人體的重要器官，它的基本功能是生成尿液,，借以清除體內(nèi)代謝產(chǎn)物及某些廢物,、毒物，同時(shí)經(jīng)重吸收功能保留水分及其他有用物質(zhì),，如葡萄糖,、蛋白質(zhì)、氨基酸,、鈉離子,、鉀離子、等,，以調(diào)節(jié)水,、電解質(zhì)平衡及維護(hù)酸堿平衡。腎臟同時(shí)還有內(nèi)分泌功能,，生成腎素,、促紅細(xì)胞生成素、活性D3,、前列腺素,、激肽等,，又為機(jī)體部分內(nèi)分泌激素的降解場(chǎng)所和腎外激素的靶器官。腎臟的這些功能,，保證了機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,，使新陳代謝得以正常進(jìn)行。腎臟內(nèi)部的結(jié)構(gòu),，可分為腎實(shí)質(zhì)和腎盂兩部分,。在腎縱切面可以看到，腎實(shí)質(zhì)分內(nèi)外兩層：外層為皮質(zhì),，內(nèi)層為髓質(zhì),。腎皮質(zhì)位于腎實(shí)質(zhì)表層，富含血管,，新鮮時(shí)呈紅褐色,，由一百多萬(wàn)個(gè)腎單位組成。每個(gè)腎單位由腎小體和腎小管所構(gòu)成,，部分皮質(zhì)伸展至髓質(zhì)錐體間,，成為腎柱。腎髓質(zhì)位于腎皮質(zhì)的深面,，血管較少,，色淡紅，為10-20個(gè)錐體所構(gòu)成,。腎錐體在切面上呈三角形,。錐體底部向腎凸面，向腎門,，錐體主要組織為集合管,，錐體稱腎乳頭，每一個(gè)乳頭有10-20個(gè)乳頭管,，向腎小盞漏斗部開口,。在腎竇內(nèi)有腎小盞，為漏斗形的膜狀小管,，圍繞腎乳頭,。腎錐體與腎小盞相連接。每腎有7～8個(gè)腎小盞,，相鄰2～3個(gè)腎小盞合成一個(gè)腎大盞,。每腎有2～3個(gè)腎大盞，腎大盞匯合成扁漏斗狀的腎盂,。腎盂出腎門后逐漸縮窄變細(xì),，移行為輸尿管。腎單位是腎臟結(jié)構(gòu)和功能的基本單位。腎小體包括腎小球和腎小囊,。腎小體內(nèi)有一個(gè)毛細(xì)血管團(tuán),，稱為腎小球，腎小球是個(gè)血管球,。它由腎動(dòng)脈分支形成,。腎小球外有腎小囊包繞。腎小囊分兩層,，兩層之間有囊腔與腎小管的管腔相通,。腎小管匯成集合管。若干集合管匯合成乳頭管,，尿液由此流入腎小盞,。微血管又稱毛細(xì)血管。分布于各種組織和細(xì)胞間的微細(xì)的血管,。介于微動(dòng)脈和微靜脈之間,。平均直徑7～9微米，數(shù)量極多,，成網(wǎng)狀分布,。管壁由一層內(nèi)皮細(xì)胞及一薄層基膜組成，厚約0.5微米,?；ね饷嬗斜咏Y(jié)締組織，其中有纖維細(xì)胞,、巨噬細(xì)胞和周細(xì)胞等,。細(xì)的毛細(xì)血管由一個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞圍成管腔，較粗的毛細(xì)血管由2～3個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞圍成,。分布于肌肉組織、組織和結(jié)締組織中的毛細(xì)血管,，內(nèi)皮細(xì)胞間為縫隙連接（縫隙寬150埃）,，稱連續(xù)毛細(xì)血管；分布于內(nèi)分泌腺,、腎臟等處的毛細(xì)血管,，除有縫隙連接外，細(xì)胞本身有許多小孔,，（孔徑800～1000埃）,，稱有孔毛細(xì)血管；分布于肝,、脾,、骨髓及某些內(nèi)分泌腺的毛細(xì)血管，管腔擴(kuò)大,，稱血竇,。毛細(xì)血管的管壁薄,、通透性大、管徑細(xì)（8～10微米）,、數(shù)量多,、血流速度慢，這些特點(diǎn)使其成為血液與組織液進(jìn)行物質(zhì)交換的場(chǎng)所,，又稱交換血管,。血竇（sinusoid）由毛細(xì)血管管腔擴(kuò)大而成，竇壁的一般結(jié)構(gòu)與毛細(xì)血管壁相同,，由單層內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成,，內(nèi)皮細(xì)胞膜上有窗孔。不同器官的竇壁結(jié)構(gòu)各有差別,。脾血竇的內(nèi)皮細(xì)胞間有較寬裂隙,；肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞是不連續(xù)的，有較寬的細(xì)胞隙（0.1～0.5微米）,；肝,、脾血竇的基膜不完整或無(wú)基膜，通透性比毛細(xì)血管大,，較大的蛋白質(zhì)和血細(xì)胞可以通過(guò),。肝血竇壁內(nèi)有枯否細(xì)胞，脾血竇內(nèi)外有巨噬細(xì)胞,，這兩種細(xì)胞都有吞噬能力,，可吞噬清除血液中的異物、細(xì)菌等有害物質(zhì),，是機(jī)體單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的重要組成分,。某些內(nèi)分泌腺的血竇有連續(xù)的基膜。

培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基：含FBS,、EGF,、bFGF、IGF,、VEGF,、Heparin、Hydrocortisone,、Penicillin,、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長(zhǎng)特性：貼壁

細(xì)胞形態(tài)：內(nèi)皮細(xì)胞樣

傳代特性：可傳2-3代

消化液：0.25%

培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%,；CO2,，5%

人腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)周期有限；建議使用配套的專用生長(zhǎng)培養(yǎng)基及正確的操作方法來(lái)培養(yǎng)，以此保證該細(xì)胞的佳培養(yǎng)狀態(tài),。

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1,、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,；

②加入2ml0.25%（T25瓶）,，使覆蓋整個(gè)瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化,；

③1-2min后,，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止,；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中,，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基,；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中,。

2,、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右,，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻,。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻,，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中,，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3,、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后,，顯微鏡下觀察細(xì)胞,，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,，加1ml凍存液重懸細(xì)胞,；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存,。

操作步驟：

1.將無(wú)菌的蓋玻片置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中,，將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞爬片，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)取出爬片,。

2. 用PBS浸洗爬片3次,，4%的多聚甲醛固定爬片15min，再次用PBS浸洗玻片3次,，每次3min,。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min，使細(xì)胞通透,。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過(guò)氧化氫），PBS沖洗3次,，每次3min,。

5. 封閉血清室溫孵育20min，PBS沖洗3次,，每次3min,。

6. 細(xì)胞特異性一抗孵育：按照抗體說(shuō)明書稀釋比例稀釋好一抗，滴加在爬片上,，于4°C濕盒中孵育一夜,，PBS沖洗3次，每次3min,。

7. 二抗孵育：選與一抗對(duì)應(yīng)的二抗,，按比例稀釋后滴加在爬片上，37°C濕盒中孵育30min,，PBS沖洗3次,，每次3min。

8. 將爬片周圍水漬吸干,，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液,，顯微鏡下觀察，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色的陽(yáng)性信號(hào)時(shí)用蒸餾水沖洗終止顯色,。

9. 復(fù)染：用Harris蘇木素復(fù)染30s~1min,，水洗后用1%的鹽酸酒精分化，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍(lán),。

10. 封片：將中性樹膠滴在爬片一側(cè),，再用蓋玻片蓋上，先放平蓋玻片一側(cè)再輕輕放下另一側(cè),，以免產(chǎn)生氣泡,，封好的爬片平放置于通風(fēng)廚中晾干,。

11. 鏡檢觀察。

公司產(chǎn)品：