人腎皮質(zhì)上皮原代細(xì)胞公司出售的產(chǎn)品：人原代卵巢顆粒細(xì)胞 人肝癌細(xì)胞 英文名稱： Li-7 BNL 1MEA.7R.1 小鼠肝上皮細(xì)胞 1ml/T75 HCT116, 人結(jié)直腸癌細(xì)胞 AAV-293 人胚細(xì)胞 小鼠原代腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞

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細(xì)胞屬性：

方法簡介

公司實(shí)驗(yàn)室分離的人腎皮質(zhì)上皮采用-膠原酶混合消化法結(jié)合差速貼壁法，并通過上皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來,，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶,。

質(zhì)量檢測

公司實(shí)驗(yàn)室分離的人腎皮質(zhì)上皮經(jīng)PCK免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上,，且不含有HIV-1,、HBV、HCV,、支原體,、細(xì)菌、酵母和真菌等,。

 

細(xì)胞簡介：

人腎皮質(zhì)上皮細(xì)胞分離自腎組織；腎臟是機(jī)體的重要器官,，它的基本功能是生成尿液,，借以清除體內(nèi)代謝產(chǎn)物及某些廢物、毒物,，同時(shí)經(jīng)重吸收功能保留水份及其他有用物質(zhì),，如葡萄糖、蛋白質(zhì),、氨基酸,、鈉離子、鉀離子,、等,，以調(diào)節(jié)水、電解質(zhì)平衡及維護(hù)酸堿平衡,。腎臟同時(shí)還有內(nèi)分泌功能,，生成腎素、促紅細(xì)胞生成素,、活性D3,、前列腺素、激肽等,，又為機(jī)體部分內(nèi)分泌激素的降解場所和腎外激素的靶器官,。腎臟的這些功能，保證了機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，使新陳代謝得以正常進(jìn)行,。

培養(yǎng)信息：

包被條件 鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培養(yǎng)基 含FBS,、生長添加劑、Penicillin,、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細(xì)胞形態(tài) 上皮細(xì)胞樣

傳代特性 可傳2-3代

消化液 0.25%

培養(yǎng)條件 氣相：空氣,，95%；CO2,，5%

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1,、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,；

②加入2ml0.25%（T25瓶）,，使覆蓋整個(gè)瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化,；

③1-2min后,，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止,；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中,，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基,；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中,。

2,、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右,，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻,。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻,，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中,，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3,、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后,，顯微鏡下觀察細(xì)胞,，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒,，放入-80℃冰箱,，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。

操作步驟：

1.將無菌的蓋玻片置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中,，將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞爬片,，待細(xì)胞長至80%時(shí)取出爬片。

2. 用PBS浸洗爬片3次,，4%的多聚甲醛固定爬片15min,，再次用PBS浸洗玻片3次，每次3min,。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min,，使細(xì)胞通透。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過氧化氫）,，PBS沖洗3次，每次3min,。

5. 封閉血清室溫孵育20min,，PBS沖洗3次，每次3min,。

6. 細(xì)胞特異性一抗孵育：按照抗體說明書稀釋比例稀釋好一抗，滴加在爬片上,，于4°C濕盒中孵育一夜,，PBS沖洗3次，每次3min,。

7. 二抗孵育：選與一抗對應(yīng)的二抗,，按比例稀釋后滴加在爬片上，37°C濕盒中孵育30min,，PBS沖洗3次,，每次3min。

8. 將爬片周圍水漬吸干,，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液,，顯微鏡下觀察，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色的陽性信號時(shí)用蒸餾水沖洗終止顯色,。

9. 復(fù)染：用Harris蘇木素復(fù)染30s~1min,，水洗后用1%的鹽酸酒精分化,，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍(lán)。

10. 封片：將中性樹膠滴在爬片一側(cè),，再用蓋玻片蓋上,，先放平蓋玻片一側(cè)再輕輕放下另一側(cè)，以免產(chǎn)生氣泡,，封好的爬片平放置于通風(fēng)廚中晾干,。

11. 鏡檢觀察。

公司產(chǎn)品：