人膀胱平滑肌原代細(xì)胞公司出售的產(chǎn)品：雞原代前脂肪細(xì)胞 肝癌 英文名稱： HCC-9204 CWBRT10 社鼠肌肉成纖維樣細(xì)胞 1ml/T75 HGC-27人胃癌細(xì)胞 311 果蠅胚胎細(xì)胞 小鼠原代胸腺上皮細(xì)胞

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細(xì)胞屬性：

方法簡(jiǎn)介

公司實(shí)驗(yàn)室分離的人膀胱平滑肌采用-膠原酶聯(lián)合消化法結(jié)合差速貼壁法制備而來(lái),，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。

質(zhì)量檢測(cè)

公司實(shí)驗(yàn)室分離的人膀胱平滑肌經(jīng)α-SMA免疫熒光鑒定,，純度可達(dá)90%以上,，且不含有HIV-1、HBV,、HCV,、支原體、細(xì)菌,、酵母和真菌等,。

 

細(xì)胞簡(jiǎn)介：

人膀胱平滑肌細(xì)胞分離自膀胱組織；膀胱是主要由平滑肌細(xì)胞組成的中空器官,，膀胱平滑肌的舒張和收縮使得膀胱分別儲(chǔ)存和排出尿液,。膀胱平滑肌細(xì)胞表型的調(diào)控和可誘導(dǎo)一氧化氮合酶的表達(dá)與多種病理狀況有關(guān)，包括膀胱功能障礙,。研究表明,，組織缺氧抑制膀胱平滑肌細(xì)胞的增殖，膀胱平滑肌細(xì)胞的分化依賴于膀胱上皮細(xì)胞釋放的因子,。膀胱平滑肌細(xì)胞外基質(zhì)的分泌表型可通過(guò)細(xì)胞所經(jīng)歷的機(jī)械變形頻率而改變,。平滑肌是許多疾病中的共同路徑,，因此，了解在疾病發(fā)生及持續(xù)過(guò)程中平滑肌怎樣變化,，這是治療方法取得進(jìn)展的重要一步,。膀胱壁由三層組織組成，由內(nèi)而外為黏膜層,、肌層和外膜,。其中，肌層主要由平滑肌構(gòu)成,。膀胱平滑肌細(xì)胞原代分離培養(yǎng)3天后,，可見(jiàn)細(xì)胞貼壁伸展，細(xì)胞形態(tài)大小不一,，呈梭形,、不規(guī)則形、三角形或扇形,，核卵圓形,、居中；2周后細(xì)胞匯合,，多數(shù)細(xì)胞伸展呈長(zhǎng)梭形,，胞漿豐富，有分枝狀突起,，細(xì)胞平行排列成單層或部分區(qū)域多層重疊生長(zhǎng),，高低起伏；細(xì)胞密度低時(shí),，常交織成網(wǎng)狀,；密度高時(shí)，則排列為旋渦狀或柵欄狀,。傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)較快,，4-6天即可匯合，并保持上述形態(tài)學(xué)特征和生長(zhǎng)特點(diǎn),。體外培養(yǎng)膀胱平滑肌細(xì)胞不僅為組織工程膀胱,、尿道提供種植細(xì)胞的必要手段，也是研究平滑肌瘤的基礎(chǔ)與前提,。

培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基 含FBS,、生長(zhǎng)添加劑、Penicillin,、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長(zhǎng)特性 貼壁

細(xì)胞形態(tài) 成纖維細(xì)胞樣

傳代特性 可傳5代左右,；3代以內(nèi)狀態(tài)佳

消化液 0.25%

培養(yǎng)條件 氣相：空氣，95%；CO2,，5%

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1,、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,；

②加入2ml0.25%（T25瓶）,，使覆蓋整個(gè)瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化,；

③1-2min后,，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止,；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中,，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基,；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中,。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化,，時(shí)間1min左右,，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻,，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基,。

3,、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后,，顯微鏡下觀察細(xì)胞,，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒,，放入-80℃冰箱,，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存,。

操作步驟：

1.將無(wú)菌的蓋玻片置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞爬片,，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)取出爬片,。

2. 用PBS浸洗爬片3次，4%的多聚甲醛固定爬片15min,，再次用PBS浸洗玻片3次,，每次3min。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min,，使細(xì)胞通透,。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過(guò)氧化氫）,，PBS沖洗3次,，每次3min。

5. 封閉血清室溫孵育20min,，PBS沖洗3次,，每次3min。

6. 細(xì)胞特異性一抗孵育：按照抗體說(shuō)明書稀釋比例稀釋好一抗,，滴加在爬片上,，于4°C濕盒中孵育一夜，PBS沖洗3次,，每次3min,。

7. 二抗孵育：選與一抗對(duì)應(yīng)的二抗，按比例稀釋后滴加在爬片上,，37°C濕盒中孵育30min,，PBS沖洗3次，每次3min,。

8. 將爬片周圍水漬吸干,，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察,，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色的陽(yáng)性信號(hào)時(shí)用蒸餾水沖洗終止顯色,。

9. 復(fù)染：用Harris蘇木素復(fù)染30s~1min，水洗后用1%的鹽酸酒精分化,，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍(lán),。

10. 封片：將中性樹(shù)膠滴在爬片一側(cè)，再用蓋玻片蓋上,，先放平蓋玻片一側(cè)再輕輕放下另一側(cè),，以免產(chǎn)生氣泡，封好的爬片平放置于通風(fēng)廚中晾干。

11. 鏡檢觀察,。

公司產(chǎn)品：