人宮頸癌成纖維原代細胞

人宮頸癌組織源成纖維細胞分離自患有宮頸癌病人的宮頸癌組織,；宮頸癌也稱子宮頸癌,，指發(fā)生在子宮陰道部及宮頸管的惡性腫瘤,，是女性常見惡性腫瘤之一,，發(fā)病率位于女性腫瘤的第二位,。宮頸癌可向鄰近組織和器官直接蔓延，向下至陰道穹窿及陰道壁,，向上可侵犯子宮體,，向兩側可侵犯盆腔組織，向前可侵犯膀胱,，向后可侵犯直腸,。也可通過淋巴管轉移至宮頸旁、髂內,、髂外,、腹股溝淋巴結，晚期甚至可轉移到鎖骨上及全身其他淋巴結,。血行轉移比較少見,，常見的轉移部位是肺、肝及骨,。腫瘤微環(huán)境即腫瘤細胞生存的外部環(huán)境,，由不同種類的非腫瘤性的細胞與細胞外基質（Extracellular matrix，ECM）構成,，包括纖維細胞,，免疫細胞，內皮細胞,，間充質干細胞等，腫瘤細胞通過調控這些間質細胞,，創(chuàng)造出有利于自身侵襲轉移的條件,，從而使得腫瘤得到進展。越來越多的證據表明,，腫瘤微環(huán)境的改變在腫瘤進展中扮演著重要的角色,。在腫瘤微環(huán)境中，研究多也是主要的間質細胞是腫瘤相關成纖維細胞（cancer-associated fibroblasts, CAFs）,。CAFs 主要由腫瘤周邊的正常成纖維細胞和成纖維細胞樣細胞演化而來,。宮頸癌組織源成纖維細胞多為突起的紡錘形或星形的扁平狀結構,，其細胞核呈規(guī)則的卵圓形，核仁大而明顯,。剛分離的宮頸癌組織源成纖維細胞呈圓形,、折光性良好，懸浮于培養(yǎng)基中,。30min細胞貼壁,，其中部分開始伸出偽足，表現為小的突起,；6h后細胞基本貼壁,，伸展成梭形，胞核清晰,，分布較均勻,，散在生長，不聚集成團,；細胞生長迅速,，5-7天即呈融合狀態(tài)，細胞排列緊密,，有的交叉重疊生長,，平坦、胞體較大,，細胞質透明,，細胞核較大，呈橢圓形,，顏色淡,。細胞融合，并彼此連接成網狀,；細胞呈突起的紡錘形或星形的扁平分布,。

產品名稱：人宮頸癌成纖維細胞

組織來源：宮頸癌組織

產品規(guī)格：5×10?Cells/T25培養(yǎng)瓶

培養(yǎng)基 含FBS、生長添加劑,、Penicillin,、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細胞形態(tài) 成纖維細胞樣

傳代特性 可傳5代左右；3代以內狀態(tài)佳

消化液 0.25%

培養(yǎng)條件 氣相：空氣,，95%,；CO2，5%

方法簡介

公司實驗室分離的人宮頸癌成纖維采用混合膠原酶消化法結合差速貼壁法制備而來,，細胞總量約為5×10?cells/瓶,。

質量檢測

公司實驗室分離的人宮頸癌成纖維經Vimentin免疫熒光鑒定，純度可達90%以上,，且不含有HIV-1,、HBV,、HCV、支原體,、細菌,、酵母和真菌等。

1,、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶）,，使覆蓋整個瓶或皿,，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后,，顯微鏡下觀察細胞,，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；若細胞還是貼壁,，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基,；

⑥懸浮細胞直接離心收集,，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2,、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化,，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻,。

②在1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中,，補加適量培養(yǎng)基,。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞,，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒,，放入-80℃冰箱,，4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存。

1）復蘇細胞：將含有 1mL 細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍,，加 入 4mL 培養(yǎng)基混合均 勻,。在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘，棄去上清液,，補 加 1-2mL 培養(yǎng)基后吹勻,。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培 養(yǎng)過夜（或將 細胞懸液加入 10cm 皿中，加入約 8ml 培養(yǎng)基,，培養(yǎng)過夜）,。第二天換液并 檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達 80%-90%,，即可進行傳代培養(yǎng),。

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣,、鎂離子的 PBS 潤洗細胞 1-2 次,。

2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于 37℃培 養(yǎng)箱中消化 1-2 分鐘,，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,，若細胞大部分 變圓并脫落，迅速拿回操作臺,，輕敲幾下培養(yǎng) 瓶后加少量培養(yǎng)基終止消 化,。

3. 按 6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出,，在 1000RPM 條件下離心 4 分 鐘,，棄去上清液，補加 1-2mL 培養(yǎng)液后吹勻,。

4. 將細胞懸液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中,。

3）細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存,。下面 T25 瓶為類,；

1. 細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后,，PBS 清洗一遍后加入 1ml ,，細胞變圓 脫 落后，加入 1ml 含血清的培養(yǎng)基終止消化,，可使用血球計數板計數,。