人肺動(dòng)脈平滑肌原代細(xì)胞公司出售的產(chǎn)品：大鼠原代腦膜成纖維細(xì)胞 RT4(人膀胱移行細(xì)胞瘤細(xì)胞) HPF 人肺成纖維細(xì)胞 1ml/T75 U-2 OS, 人骨肉瘤細(xì)胞 Human C3H/10T1/2, Clone 8 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞 大鼠原代破骨細(xì)胞

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細(xì)胞屬性：

方法簡(jiǎn)介

實(shí)驗(yàn)室分離的人肺動(dòng)脈平滑肌采用蛋白酶 - 膠原酶聯(lián)合消化法制備而來,，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶,。

質(zhì)量檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)室分離的人肺動(dòng)脈平滑肌經(jīng)α-SMA免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上,，且不含有HIV-1,、HBV、HCV,、支原體,、細(xì)菌、酵母和真菌等,。

 

細(xì)胞簡(jiǎn)介：

人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞分離自肺動(dòng)脈組織,；肺動(dòng)脈亦稱肺動(dòng)脈干,。在呼吸空氣的脊椎動(dòng)物中,，把靜脈血由心臟導(dǎo)向肺臟的動(dòng)脈,。肺動(dòng)脈起于右心室，在主動(dòng)脈之前向左上后方斜行，在主動(dòng)脈弓下方分為左,、右肺動(dòng)脈,，經(jīng)肺門入肺。肺動(dòng)脈干位于心包內(nèi),，為一粗短的動(dòng)脈干,。起自右心室，在升主動(dòng)脈前方向左后上方斜行,，至主動(dòng)脈弓下方分為左,、右肺動(dòng)脈,。左肺動(dòng)脈較短,，在左主支氣管前方橫行,，分二支進(jìn)入左肺上,、下葉,。右肺動(dòng)脈較長(zhǎng)而粗,，經(jīng)升主動(dòng)脈和上腔靜脈后方向右橫行，至右肺門處分為三支進(jìn)入右肺上,、中,、下葉。肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞是肺血管的重要結(jié)構(gòu)細(xì)胞之一,，在調(diào)控肺血管的收縮和舒張功能中有重要作用,。肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞原代分離培養(yǎng)3天后，可見細(xì)胞貼壁伸展,，細(xì)胞形態(tài)大小不一，呈梭形,、不規(guī)則形,、三角形或扇形,，核卵圓形,、居中,；2周后細(xì)胞匯合,，多數(shù)細(xì)胞伸展呈長(zhǎng)梭形,，胞漿豐富，有分枝狀突起,，細(xì)胞平行排列成單層或部分區(qū)域多層重疊生長(zhǎng)，高低起伏,；細(xì)胞密度低時(shí),，常交織成網(wǎng)狀；密度高時(shí),，則排列為旋渦狀或柵欄狀,。傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)較快,，4-6天即可匯合,，并保持上述形態(tài)學(xué)特征和生長(zhǎng)特點(diǎn),。肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的異常是肺動(dòng)脈高壓發(fā)生發(fā)展的重要病理學(xué)特征,，其凋亡和增殖失衡是肺血管重塑的關(guān)鍵,。研究表明,，急性和慢性缺氧均可導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓,，即缺氧性肺動(dòng)脈高壓,，推斷缺氧可能是通過促進(jìn)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖而參與缺氧性肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生發(fā)展,。肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞主要功能：①細(xì)胞表面表達(dá)介質(zhì)（ICAM-1和VCAM-1）參與血管壁炎癥反應(yīng)；②是多數(shù)重要?jiǎng)用}疾病的靶細(xì)胞,。肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞與主要病生理變化：①平滑肌增生易致肺動(dòng)脈高壓,；②先天性肺動(dòng)脈狹窄；③肺動(dòng)脈栓塞,。

培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基：含FBS、EGF,、bFGF,、Insulin,、Penicillin,、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長(zhǎng)特性：貼壁

細(xì)胞形態(tài)：成纖維細(xì)胞樣

傳代特性：可傳3-5代左右

消化液：0.25%

培養(yǎng)條件：氣相：空氣,，95%；CO2,，5%

人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞體外培養(yǎng)周期有限；建議使用配套的專用生長(zhǎng)培養(yǎng)基及正確的操作方法來培養(yǎng),，以此保證該細(xì)胞的佳培養(yǎng)狀態(tài),。

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個(gè)瓶或皿,，蓋好放入培養(yǎng)箱消化,；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞,，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁,，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中,，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集,，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中,。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化,，時(shí)間1min左右,，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻,。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻,，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中,，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3,、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后,，顯微鏡下觀察細(xì)胞,，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞,；

④將凍存管放入程序降溫盒,，放入-80℃冰箱，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存,。

操作步驟：

1.將無菌的蓋玻片置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中,，將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞爬片，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)取出爬片,。

2. 用PBS浸洗爬片3次,，4%的多聚甲醛固定爬片15min，再次用PBS浸洗玻片3次,，每次3min,。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min，使細(xì)胞通透,。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過氧化氫），PBS沖洗3次,，每次3min。

5. 封閉血清室溫孵育20min,，PBS沖洗3次,，每次3min。

6. 細(xì)胞特異性一抗孵育：按照抗體說明書稀釋比例稀釋好一抗,，滴加在爬片上,，于4°C濕盒中孵育一夜,，PBS沖洗3次，每次3min,。

7. 二抗孵育：選與一抗對(duì)應(yīng)的二抗,，按比例稀釋后滴加在爬片上，37°C濕盒中孵育30min,，PBS沖洗3次,，每次3min。

8. 將爬片周圍水漬吸干,，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液,，顯微鏡下觀察，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色的陽性信號(hào)時(shí)用蒸餾水沖洗終止顯色,。

9. 復(fù)染：用Harris蘇木素復(fù)染30s~1min,，水洗后用1%的鹽酸酒精分化，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍(lán),。

10. 封片：將中性樹膠滴在爬片一側(cè),，再用蓋玻片蓋上，先放平蓋玻片一側(cè)再輕輕放下另一側(cè),，以免產(chǎn)生氣泡,，封好的爬片平放置于通風(fēng)廚中晾干。

11. 鏡檢觀察,。

公司產(chǎn)品：