人肺癌成纖維原代細(xì)胞公司出售的產(chǎn)品：大鼠原代口腔粘膜成纖維細(xì)胞 RAG(小鼠腺癌細(xì)胞) 2F7 人肺癌雜交細(xì)胞 1ml/T75 SKOV3/Taxol-25, 人癌耐藥細(xì)胞株 Human MouseM 小鼠肌肉細(xì)胞 大鼠原代乳腺成纖維細(xì)胞

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細(xì)胞屬性：

方法簡介

實驗室分離的人肺癌成纖維采用 - 膠原酶混合酶消化后差速貼壁制備而來,，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。

質(zhì)量檢測

實驗室分離的人肺癌成纖維經(jīng)Vimentin免疫熒光鑒定,，純度可達(dá)90%以上,，且不含有HIV-1,、HBV、HCV,、支原體,、細(xì)菌、酵母和真菌等,。

 

細(xì)胞簡介：

人肺癌成纖維細(xì)胞分離自肺癌組織,；肺癌是常見的肺原發(fā)性惡性腫瘤，絕大多數(shù)肺癌起源于支氣管粘膜上皮,，故亦稱支氣管肺癌,。肺癌可向四周乃至全身擴(kuò)散,。肺癌發(fā)病率和死亡率增長快,，對人群健康和生命威脅大的惡性腫瘤之一,。近50年來許多國家都報道肺癌的發(fā)病率和死亡率均明顯增高，男性肺癌發(fā)病率和死亡率均占所有惡性腫瘤的,，女性發(fā)病率占第二位,，死亡率占第二位。肺癌的病因至今尚不明確,，大量資料表明,，長期大量吸煙與肺癌的發(fā)生有非常密切的關(guān)系。肺癌,，其實不是一種病,，而是幾十種病的組合，有多種亞型,，多種特性,；根據(jù)肺癌細(xì)胞在顯微鏡下的形態(tài)特點，可以初步分為兩種類型：小細(xì)胞肺癌(SCLC)15%和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)85%,。這兩種類型肺癌的生長特點,、擴(kuò)散風(fēng)險和治療方案均不相同。絕大多數(shù)肺癌是非小細(xì)胞肺癌,，約占85%,。它又能進(jìn)一步被分為三類，分別是：腺癌,，鱗癌和大細(xì)胞癌,。其中腺癌是主要的類型，約占非小細(xì)胞肺癌中的50%,。如果是不吸煙的女性患者，幾乎全部都是腺癌,。人肺癌成纖維細(xì)胞是肺癌組織中的癌相關(guān)成纖維細(xì)胞,，癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer associated fibroblast,，CAF)在腫瘤微環(huán)境中的重要作用已受到廣泛的重視。該細(xì)胞通過與癌細(xì)胞的直接接觸,、分泌多種因子以及對腫瘤基質(zhì)的改造,，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,、轉(zhuǎn)移甚至耐藥性的發(fā)生,。隨著研究的深入，有人提出CAF可能成為抗的新靶點,。然而CAF的分化來源多樣,，相應(yīng)的形態(tài)和功能各異，因此深入了解CAF的分化來源有利于更全面地認(rèn)識腫瘤發(fā)展的機(jī)制,，為臨床治療提供理論依據(jù),，體外培養(yǎng)肺癌成纖維細(xì)胞對肺癌研究有重要意義。

培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基：含FBS,、生長添加劑,、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：貼壁

細(xì)胞形態(tài)：成纖維細(xì)胞樣

傳代特性：可傳5代左右,；3代以內(nèi)狀態(tài)佳

消化液：0.25%

培養(yǎng)條件：氣相：空氣,，95%；CO2,，5%

人肺癌成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)周期有限,；建議使用配套的專用生長培養(yǎng)基及正確的操作方法來培養(yǎng)，以此保證該細(xì)胞的佳培養(yǎng)狀態(tài),。

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1,、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,；

②加入2ml0.25%（T25瓶）,，使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化,；

③1-2min后,，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止,；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中,，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基,；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集,，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2,、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化,，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻,。

②在1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中,，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基,。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞,，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒,，放入-80℃冰箱,，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。

操作步驟：

1.將無菌的蓋玻片置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中,，將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞爬片,，待細(xì)胞長至80%時取出爬片。

2. 用PBS浸洗爬片3次,，4%的多聚甲醛固定爬片15min,，再次用PBS浸洗玻片3次，每次3min,。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min,，使細(xì)胞通透。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過氧化氫）,，PBS沖洗3次，每次3min,。

5. 封閉血清室溫孵育20min,，PBS沖洗3次，每次3min,。

6. 細(xì)胞特異性一抗孵育：按照抗體說明書稀釋比例稀釋好一抗,，滴加在爬片上,，于4°C濕盒中孵育一夜,，PBS沖洗3次,，每次3min。

7. 二抗孵育：選與一抗對應(yīng)的二抗,，按比例稀釋后滴加在爬片上,，37°C濕盒中孵育30min，PBS沖洗3次,，每次3min,。

8. 將爬片周圍水漬吸干，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液,，顯微鏡下觀察,，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色的陽性信號時用蒸餾水沖洗終止顯色。

9. 復(fù)染：用Harris蘇木素復(fù)染30s~1min,，水洗后用1%的鹽酸酒精分化,，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍(lán)。

10. 封片：將中性樹膠滴在爬片一側(cè),，再用蓋玻片蓋上,，先放平蓋玻片一側(cè)再輕輕放下另一側(cè)，以免產(chǎn)生氣泡,，封好的爬片平放置于通風(fēng)廚中晾干,。

11. 鏡檢觀察。

公司產(chǎn)品：