人表皮角質(zhì)形成原代細胞公司出售的產(chǎn)品：大鼠原代肌腱干細胞 PA-1(人腺癌細胞) BEAS-2B 人支氣管上皮樣細胞 1ml/T75 B16-F10, 小鼠黑色素瘤高轉(zhuǎn)移細胞 Mouse KMML1 小白鼠肺成纖維樣細胞 大鼠原代腎動脈平滑肌細胞

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細胞屬性：

方法簡介

公司實驗室分離的人表皮角質(zhì)形成層細胞先蛋白酶消化、后-膠原酶混合消化法制備而來,，細胞總量約為5×10?cells/瓶,。

質(zhì)量檢測

公司實驗室分離的人表皮角質(zhì)形成經(jīng)PCK免疫熒光鑒定，純度可達90%以上,，且不含有HIV-1,、HBV、HCV,、支原體,、細菌,、酵母和真菌等。

 

細胞簡介：

人表皮角質(zhì)形成細胞分離自皮膚組織,；表皮位于動物皮膚的外層,，由胚胎時期外胚層形成，具有抗摩擦和抗損傷的作用,。表皮是皮膚的淺層結(jié)構(gòu),，由復(fù)層扁平上皮構(gòu)成。從基底層到表面可分為五層,，即基底層,、棘層、顆粒層,、透明層和角質(zhì)層,。表皮角質(zhì)形成細胞是一種能合成角質(zhì)蛋白的上皮細胞，此類細胞為表皮的主體,，由表皮深層始逐漸增殖,、分化，并在成為角化的角質(zhì)細胞中,，細胞核與細胞器消失,，細胞亦失去生理功能而脫落。未脫落部分對機體尚有保護作用,，故不必在洗擦身體時用力搓擦,，使其過早脫失。表皮角質(zhì)形成細胞主要分布于表皮基底層,，在上皮程序性死亡后,，細胞產(chǎn)生角化并移向表皮。體外培養(yǎng)的表皮角化細胞容易導(dǎo)致終末分化,，不能充分增殖,。角質(zhì)形成細胞終產(chǎn)生角質(zhì)蛋白，在其向角質(zhì)細胞演變過程中,，一般可以分為四層,，即基底層、棘層,、顆粒層以及角質(zhì)層,。有人把前三層或前二層稱為生發(fā)層或馬爾匹基層。此外,，在某些部位,，特別在掌跖部位，角質(zhì)層下方還可見到透明層,。

培養(yǎng)信息：

包被條件 鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培養(yǎng)基 含FBS,、生長添加劑,、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細胞形態(tài) 上皮細胞樣

傳代特性 可傳1-2代

消化液 0.25%

培養(yǎng)條件 氣相：空氣,，95%,；CO2，5%

細胞培養(yǎng)方法：

1,、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶）,，使覆蓋整個瓶或皿,，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后,，顯微鏡下觀察細胞,，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；若細胞還是貼壁,，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基,；

⑥懸浮細胞直接離心收集,，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2,、細胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化,，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻,。

②在1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中,，補加適量培養(yǎng)基,。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞,，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒,，放入-80℃冰箱,，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。

操作步驟：

1.將無菌的蓋玻片置于細胞培養(yǎng)皿中,，將細胞懸液接種于培養(yǎng)皿中進行細胞爬片,，待細胞長至80%時取出爬片。

2. 用PBS浸洗爬片3次,，4%的多聚甲醛固定爬片15min,，再次用PBS浸洗玻片3次，每次3min,。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min,，使細胞通透。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過氧化氫）,，PBS沖洗3次，每次3min,。

5. 封閉血清室溫孵育20min,，PBS沖洗3次，每次3min,。

6. 細胞特異性一抗孵育：按照抗體說明書稀釋比例稀釋好一抗,，滴加在爬片上，于4°C濕盒中孵育一夜,，PBS沖洗3次,，每次3min。

7. 二抗孵育：選與一抗對應(yīng)的二抗,，按比例稀釋后滴加在爬片上,，37°C濕盒中孵育30min，PBS沖洗3次,，每次3min,。

8. 將爬片周圍水漬吸干，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液,，顯微鏡下觀察,，當出現(xiàn)棕黃色或棕褐色的陽性信號時用蒸餾水沖洗終止顯色。

9. 復(fù)染：用Harris蘇木素復(fù)染30s~1min,，水洗后用1%的鹽酸酒精分化,，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍。

10. 封片：將中性樹膠滴在爬片一側(cè)，再用蓋玻片蓋上,，先放平蓋玻片一側(cè)再輕輕放下另一側(cè),，以免產(chǎn)生氣泡，封好的爬片平放置于通風廚中晾干,。

11. 鏡檢觀察,。

公司產(chǎn)品：