Ⅱ型肺泡上皮原代細胞

人Ⅱ型肺泡上皮細胞分離自肺組織,；肺泡由單層上皮細胞構成的半球狀囊泡,。肺中的支氣管經多次反復分枝成無數細支氣管，它們的末端膨大成囊,，囊的四周有很多突出的小囊泡,，即為肺泡。小肺泡細胞,，又稱I型肺泡細胞,，厚約0.1微米，基底部是基底膜,，無增殖能力,。大肺泡細胞,，又稱Ⅱ型肺泡細胞，分泌表面活性物質（二棕櫚酰）,，以降低肺泡表面張力,。Ⅱ型肺泡細胞位于Ⅰ型肺泡細胞之間，數量較Ⅰ型肺泡細胞多,，但覆蓋面積比Ⅰ型肺泡細胞小,。細胞立方形或圓形,頂端突入肺泡腔。細胞核圓形,，胞質著色淺,、呈泡沫狀。電鏡下,，細胞游離而有少量微絨毛,，胞質內富含線粒體和溶酶體，有較發(fā)達的粗面內質網和高爾基復合體,。核上方有較多的分泌顆粒,，電子密度高、大小不等,，直徑約0.1-1.0μm顆粒內含有平行排列的板層狀結構,，稱為嗜餓性板層小體。小體內的主要成分為磷脂,，以二棕櫚酰為主,，此外還有糖胺多糖及蛋白質等。顆粒內物質釋放出來后,，在肺泡表面形成一層粘液層,，稱為表面活性物質（surfactant）。表面活性物質有降低肺泡表面張力,、穩(wěn)定肺泡大小的作用,。呼氣時肺泡縮小，表面活性物質密度增加,，表面張力降低,，防止肺泡過度塌陷；吸氣時肺泡擴張,，表面活性物質密度減小,，肺泡回縮力加大，可防止肺泡過度膨脹,。表面活性物質的缺乏或變性均可引起肺不張,，過度通氣可造成表面活性物質缺乏；吸入毒氣可直接破壞表面活性物質。Ⅱ型肺泡細胞有分裂,、增殖并分化為Ⅰ型肺泡細胞的潛能,，故具有修復受損傷上皮的作用。

產品名稱：人Ⅱ型肺泡上皮細胞

組織來源：肺組織

產品規(guī)格：5×10?Cells/T25培養(yǎng)瓶

包被條件 鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培養(yǎng)基 含FBS,、生長添加劑,、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細胞形態(tài) 上皮細胞樣

傳代特性 可傳1-2代左右

消化液 0.25%

培養(yǎng)條件 氣相：空氣,，95%,；CO2，5%

方法簡介

公司實驗室分離的人Ⅱ型肺泡上皮采用彈消化法制備而來制備而來,，細胞總量約為5×10?cells/瓶,。

質量檢測

公司實驗室分離的人Ⅱ型肺泡上皮經SP-C免疫熒光鑒定，純度可達90%以上,，且不含有HIV-1,、HBV、HCV,、支原體,、細菌、酵母和真菌等,。

1,、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿,，蓋好放入培養(yǎng)箱消化,；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞,，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落,，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；若細胞還是貼壁,，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止,；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中,，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細胞直接離心收集,，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中,。

2、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右,，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻,。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻,，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中,，補加適量培養(yǎng)基。

3,、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后,，顯微鏡下觀察細胞,，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞,；

④將凍存管放入程序降溫盒,，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存,。

1）復蘇細胞：將含有 1mL 細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍,，加 入 4mL 培養(yǎng)基混合均 勻。在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘,，棄去上清液,，補 加 1-2mL 培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培 養(yǎng)過夜（或將 細胞懸液加入 10cm 皿中,，加入約 8ml 培養(yǎng)基,，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并 檢查細胞密度,。

2）細胞傳代：如果細胞密度達 80%-90%,，即可進行傳代培養(yǎng)。

1. 棄去培養(yǎng)上清,，用不含鈣,、鎂離子的 PBS 潤洗細胞 1-2 次。

2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中,，置于 37℃培 養(yǎng)箱中消化 1-2 分鐘,，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分 變圓并脫落,，迅速拿回操作臺,，輕敲幾下培養(yǎng) 瓶后加少量培養(yǎng)基終止消 化,。

3. 按 6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出,，在 1000RPM 條件下離心 4 分 鐘,，棄去上清液，補加 1-2mL 培養(yǎng)液后吹勻,。

4. 將細胞懸液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中,。

3）細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存,。下面 T25 瓶為類,；

1. 細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后,，PBS 清洗一遍后加入 1ml ,，細胞變圓 脫 落后，加入 1ml 含血清的培養(yǎng)基終止消化,，可使用血球計數板計數,。