大鼠直腸平滑肌原代細(xì)胞公司出售的產(chǎn)品：小鼠原代胸腺上皮細(xì)胞 HFT-8810(人胎兒胸腺細(xì)胞株) PLC/PRF/5 人肝癌細(xì)胞 1ml/T75 MLA144 MLA144長(zhǎng)臂猿淋巴瘤細(xì)胞 Marc145 猴胚胎上皮細(xì)胞 雞原代前脂肪細(xì)胞

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細(xì)胞屬性：

方法簡(jiǎn)介

公司實(shí)驗(yàn)室分離的大鼠直腸平滑肌采用-膠原酶聯(lián)合消化法結(jié)合差速貼壁法制備而來(lái),，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。

質(zhì)量檢測(cè)

公司實(shí)驗(yàn)室分離的大鼠直腸平滑肌經(jīng)α-SMA免疫熒光鑒定,，純度可達(dá)90%以上,，且不含有HIV-1,、HBV、HCV,、支原體,、細(xì)菌、酵母和真菌等,。

 

細(xì)胞簡(jiǎn)介：

大鼠直腸平滑肌細(xì)胞分離自直腸組織,；直腸為大腸的未段，位于小骨盆內(nèi),。上端平第3骶椎處接續(xù)乙狀結(jié)腸,，沿骶骨和尾骨的前面下行，穿過(guò)盆膈,，下端以門(mén)而終,。直腸上端的大小似結(jié)腸，其下端擴(kuò)大成直腸壺腹,，是糞便排出前的暫存部位,，下端變細(xì)接管。直腸在盆腔內(nèi)的位置與骶椎腹面關(guān)系密切,，與骶椎有相同的曲度,。直腸周?chē)嘀尽o(wú)縱帶,，位于膀胱和生殖器官的背側(cè),。直腸平滑肌細(xì)胞原代分離培養(yǎng)3天后，可見(jiàn)細(xì)胞貼壁伸展,，細(xì)胞形態(tài)大小不一,，呈梭形,、不規(guī)則形,、三角形或扇形，核卵圓形,、居中,；2周后細(xì)胞匯合，多數(shù)細(xì)胞伸展呈長(zhǎng)梭形,，胞漿豐富,，有分枝狀突起，細(xì)胞平行排列成單層或部分區(qū)域多層重疊生長(zhǎng),，高低起伏,；細(xì)胞密度低時(shí)，常交織成網(wǎng)狀,；密度高時(shí),，則排列為旋渦狀或柵欄狀,。傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)較快，4-6天即可匯合,，并保持上述形態(tài)學(xué)特征和生長(zhǎng)特點(diǎn),。直腸的動(dòng)脈血供主要是來(lái)自腸系膜下動(dòng)脈的直腸上動(dòng)脈，來(lái)自髂內(nèi)動(dòng)脈的直腸中動(dòng)脈和來(lái)自髂內(nèi)動(dòng)脈的直腸下動(dòng)脈,。平滑肌收縮是胃腸蠕動(dòng)中基本的運(yùn)動(dòng)方式,；腸炎時(shí)由于平滑肌特殊肌動(dòng)蛋白的增加導(dǎo)致了平滑肌層的增厚。平滑肌肌動(dòng)蛋白可能影響收縮力的產(chǎn)生,，這進(jìn)一步證明了炎癥時(shí)的腸平滑肌細(xì)胞具有可塑性,。利用腸平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)，可以幫助了解收縮,、增殖和胃腸道結(jié)締組織對(duì)平滑肌細(xì)胞的反應(yīng),。

培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基 含FBS、生長(zhǎng)添加劑,、Penicillin,、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長(zhǎng)特性 貼壁

細(xì)胞形態(tài) 成纖維細(xì)胞樣

傳代特性 可傳5代左右；3代以?xún)?nèi)狀態(tài)佳

消化液 0.25%

培養(yǎng)條件 氣相：空氣,，95%,；CO2，5%

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1,、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶）,，使覆蓋整個(gè)瓶或皿,，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后,，顯微鏡下觀察細(xì)胞,，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；若細(xì)胞還是貼壁,，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基,；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集,，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2,、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化,，時(shí)間1min左右,，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻,，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基,。

3,、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后,，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,，加1ml凍存液重懸細(xì)胞,；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱,，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存,。

公司產(chǎn)品：

1.將無(wú)菌的蓋玻片置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中,，將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞爬片,，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)取出爬片。

2. 用PBS浸洗爬片3次,，4%的多聚甲醛固定爬片15min,，再次用PBS浸洗玻片3次，每次3min,。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min,，使細(xì)胞通透。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過(guò)氧化氫）,，PBS沖洗3次，每次3min,。

5. 封閉血清室溫孵育20min，PBS沖洗3次,，每次3min,。

6. 細(xì)胞特異性一抗孵育：按照抗體說(shuō)明書(shū)稀釋比例稀釋好一抗，滴加在爬片上,，于4°C濕盒中孵育一夜,，PBS沖洗3次,，每次3min。

7. 二抗孵育：選與一抗對(duì)應(yīng)的二抗,，按比例稀釋后滴加在爬片上,，37°C濕盒中孵育30min，PBS沖洗3次,，每次3min,。

8. 將爬片周?chē)疂n吸干，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液,，顯微鏡下觀察,，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色的陽(yáng)性信號(hào)時(shí)用蒸餾水沖洗終止顯色。

9. 復(fù)染：用Harris蘇木素復(fù)染30s~1min,，水洗后用1%的鹽酸酒精分化,，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍(lán)。

10. 封片：將中性樹(shù)膠滴在爬片一側(cè),，再用蓋玻片蓋上,，先放平蓋玻片一側(cè)再輕輕放下另一側(cè)，以免產(chǎn)生氣泡,，封好的爬片平放置于通風(fēng)廚中晾干,。

11. 鏡檢觀察。