大鼠羊膜間質(zhì)原代細(xì)胞公司出售的產(chǎn)品：小鼠原代腎小球內(nèi)皮細(xì)胞 Calu-6(人肺退行性癌細(xì)胞) HLCL 9B10 人類淋巴母細(xì)胞瘤細(xì)胞 1ml/T75 PC-12（未分化） 大鼠上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞（未分化） Mv 1 lu 貂肺上皮細(xì)胞 人原代骨髓單個(gè)核細(xì)胞

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細(xì)胞屬性：

方法簡(jiǎn)介

公司實(shí)驗(yàn)室分離的大鼠羊膜間質(zhì)采用-膠原酶聯(lián)合消化法制備而來(lái)，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶,。

質(zhì)量檢測(cè)

公司實(shí)驗(yàn)室分離的大鼠羊膜間質(zhì)經(jīng)Vimentin免疫熒光鑒定,，純度可達(dá)90%以上,，且不含有HIV-1、HBV,、HCV,、支原體、細(xì)菌,、酵母和真菌等,。

 

細(xì)胞簡(jiǎn)介：

大鼠羊膜間質(zhì)細(xì)胞分離自胎盤組織；胎盤（placenta）是哺乳動(dòng)物妊娠期間由胚胎的胚膜和母體子宮內(nèi)膜聯(lián)合長(zhǎng)成的母子間交換物質(zhì)的過(guò)渡性器官,，由羊膜,、葉狀絨毛膜和底蛻膜構(gòu)成。胎兒在子宮中發(fā)育,，依靠胎盤從母體取得營(yíng)養(yǎng),，而雙方保持相當(dāng)?shù)莫?dú)立性。胎盤還產(chǎn)生多種維持妊娠的激素,，是一個(gè)重要的內(nèi)分泌器官,。有些爬行類和魚(yú)類也以胎生方式繁殖后代，胚胎生長(zhǎng)出一些輔助結(jié)構(gòu)如卵黃囊,、鰓絲等與母體組織緊密結(jié)合,，以達(dá)到母子間物質(zhì)的交換，這樣的結(jié)構(gòu)稱假胎盤,。羊膜是胎盤的內(nèi)層,，與眼結(jié)膜組織結(jié)構(gòu)相似，含有眼表上皮細(xì)胞,，包括結(jié)膜細(xì)胞和角膜上皮細(xì)胞生長(zhǎng)所需要的物質(zhì),，其光滑，無(wú)血管,、及淋巴，具有一定的彈性,；在電鏡下,，其分為五層：上皮層、基底膜,、致密層,、纖維母細(xì)胞層和海綿層，羊膜基底膜和羊膜羊膜基質(zhì)層含有大量不同的膠元,，主要為Ⅰ,、Ⅲ、Ⅳ,、Ⅴ,、Ⅶ型膠原和纖維粘連蛋白,、層粘連蛋白等成份。羊膜細(xì)胞主要由羊膜上皮細(xì)胞和羊膜間充質(zhì)細(xì)胞組成,，均具有多分化潛能,，可轉(zhuǎn)化為元，且還有合成,、釋放生物活性物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)因子的功能,。

培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基 含FBS、生長(zhǎng)添加劑,、Penicillin,、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長(zhǎng)特性 貼壁

細(xì)胞形態(tài) 成纖維細(xì)胞樣

傳代特性 可傳3代左右

消化液 0.25%

培養(yǎng)條件 氣相：空氣，95%,；CO2,，5%

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個(gè)瓶或皿,，蓋好放入培養(yǎng)箱消化,；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞,，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁,，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止,；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中,，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集,，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中,。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化,，時(shí)間1min左右,，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻,，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基,。

3,、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后,，顯微鏡下觀察細(xì)胞,，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞,；

④將凍存管放入程序降溫盒,，放入-80℃冰箱，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存,。

公司產(chǎn)品：

1.將無(wú)菌的蓋玻片置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞爬片,，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)取出爬片,。

2. 用PBS浸洗爬片3次，4%的多聚甲醛固定爬片15min,，再次用PBS浸洗玻片3次,，每次3min。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min,，使細(xì)胞通透,。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過(guò)氧化氫）,，PBS沖洗3次,，每次3min。

5. 封閉血清室溫孵育20min,，PBS沖洗3次,，每次3min。

6. 細(xì)胞特異性一抗孵育：按照抗體說(shuō)明書(shū)稀釋比例稀釋好一抗,，滴加在爬片上,，于4°C濕盒中孵育一夜，PBS沖洗3次,，每次3min。

7. 二抗孵育：選與一抗對(duì)應(yīng)的二抗,，按比例稀釋后滴加在爬片上,，37°C濕盒中孵育30min,，PBS沖洗3次,，每次3min,。

8. 將爬片周圍水漬吸干，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液,，顯微鏡下觀察,，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色的陽(yáng)性信號(hào)時(shí)用蒸餾水沖洗終止顯色。

9. 復(fù)染：用Harris蘇木素復(fù)染30s~1min,，水洗后用1%的鹽酸酒精分化,，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍(lán)。

10. 封片：將中性樹(shù)膠滴在爬片一側(cè),，再用蓋玻片蓋上,，先放平蓋玻片一側(cè)再輕輕放下另一側(cè)，以免產(chǎn)生氣泡,，封好的爬片平放置于通風(fēng)廚中晾干,。

11. 鏡檢觀察。