大鼠心臟干原代細(xì)胞公司出售的產(chǎn)品：小鼠原代卵巢上皮細(xì)胞 M-NFS-60 (小鼠白血病細(xì)胞G-CSF依賴性) A-431 人皮膚鱗癌細(xì)胞 1ml/T75 CBRH-7919 大鼠肝癌細(xì)胞 CHO-K1 倉(cāng)鼠細(xì)胞亞株 人原代腦動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞

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細(xì)胞屬性：

方法簡(jiǎn)介

公司實(shí)驗(yàn)室分離的大鼠心臟干采用機(jī)械剪碎組織,、膠原酶分次消化法結(jié)合差速貼壁、心臟干細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來(lái),，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶,。

質(zhì)量檢測(cè)

公司實(shí)驗(yàn)室分離的大鼠心臟干經(jīng)c-kit免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上,，且不含有HIV-1,、HBV、HCV,、支原體,、細(xì)菌、酵母和真菌等,。

 

細(xì)胞簡(jiǎn)介：

大鼠心臟干細(xì)胞分離自心臟組織,；心臟是脊椎動(dòng)物身體中重要的一個(gè)器官，主要功能是為血液流動(dòng)提供壓力,，把血液運(yùn)行至身體各個(gè)部分,。心臟由心肌構(gòu)成，左心房,、左心室,、右心房、右心室四個(gè)腔組成,。左右心房之間和左右心室之間均由間隔隔開,，故互不相通，心房與心室之間有瓣膜（房室瓣）,，這些瓣膜使血液只能由心房流入心室,，而不能倒流。心臟的作用是推動(dòng)血液流動(dòng),，向器官,、組織提供充足的血流量，以供應(yīng)氧和各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),，并帶走代謝的終產(chǎn)物（如二氧化碳,、無(wú)機(jī)鹽、尿素和尿酸等）,，使細(xì)胞維持正常的代謝和功能,。研究發(fā)現(xiàn)，心臟干細(xì)胞是一種多潛能細(xì)胞,，具有再生和克隆能力,，并可分化為心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞,。體內(nèi)研究顯示,，從心臟中分離出的心臟干細(xì)胞，經(jīng)體外簡(jiǎn)單培養(yǎng),、增殖和標(biāo)記后,，移植到心肌梗死邊緣區(qū)域，心梗血流動(dòng)力學(xué)和心室壁厚度較對(duì)照組明顯改善,，心肌梗死邊緣區(qū)域發(fā)現(xiàn)有標(biāo)記的心肌細(xì)胞,、平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。盡管其新生心肌細(xì)胞較小,，但表達(dá)一些特殊肌蛋白如心臟肌球蛋白重鏈,、α-肌動(dòng)蛋白、α-輔肌動(dòng)蛋白,、連接蛋白等,，證實(shí)了心臟干細(xì)胞對(duì)心肌梗死的修復(fù)作用。干細(xì)胞移植治療是目前心肌梗死和缺血性心臟病細(xì)胞重建的主要方法,，成體干細(xì)胞中的c-kit陽(yáng)性心臟干細(xì)胞因其來(lái)源于心臟,，有定向心臟細(xì)胞系分化的趨勢(shì)，體內(nèi)外可以分化成心肌細(xì)胞,、血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞,，同時(shí)自體移植不存在免疫排斥反應(yīng)及倫理問(wèn)題已經(jīng)成為目前研究的熱點(diǎn)。短期內(nèi)獲得治療量的自體心臟干細(xì)胞是這一治療應(yīng)用于臨床的關(guān)鍵所在。因此,，研究一種新的分離培養(yǎng)方法可在短時(shí)期內(nèi)獲得大量純度較高的自體c-kit陽(yáng)性心臟干細(xì)胞成為目前干細(xì)胞領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。

培養(yǎng)信息：

包被條件 PLL（0.1mg/ml）

培養(yǎng)基 含FBS,、生長(zhǎng)添加劑,、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長(zhǎng)特性 貼壁

細(xì)胞形態(tài) 長(zhǎng)梭形

傳代特性 可傳3代左右

消化液 0.25%

培養(yǎng)條件 氣相：空氣,，95%,；CO2，5%

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1,、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶）,，使覆蓋整個(gè)瓶或皿,，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后,，顯微鏡下觀察細(xì)胞,，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；若細(xì)胞還是貼壁,，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基,；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集,，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2,、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化,，時(shí)間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻,。

②在1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中,，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基,。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,，加1ml凍存液重懸細(xì)胞,；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱,，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存,。

公司產(chǎn)品：

操作步驟：

1.將無(wú)菌的蓋玻片置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞爬片,，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)取出爬片,。

2. 用PBS浸洗爬片3次，4%的多聚甲醛固定爬片15min,，再次用PBS浸洗玻片3次,，每次3min。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min,，使細(xì)胞通透,。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過(guò)氧化氫）,，PBS沖洗3次,，每次3min。

5. 封閉血清室溫孵育20min,，PBS沖洗3次,，每次3min。

6. 細(xì)胞特異性一抗孵育：按照抗體說(shuō)明書稀釋比例稀釋好一抗,，滴加在爬片上,，于4°C濕盒中孵育一夜，PBS沖洗3次,，每次3min,。

7. 二抗孵育：選與一抗對(duì)應(yīng)的二抗，按比例稀釋后滴加在爬片上,，37°C濕盒中孵育30min,，PBS沖洗3次，每次3min,。

8. 將爬片周圍水漬吸干,，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液,，顯微鏡下觀察，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色的陽(yáng)性信號(hào)時(shí)用蒸餾水沖洗終止顯色,。

9. 復(fù)染：用Harris蘇木素復(fù)染30s~1min,，水洗后用1%的鹽酸酒精分化，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍(lán),。

10. 封片：將中性樹膠滴在爬片一側(cè),，再用蓋玻片蓋上，先放平蓋玻片一側(cè)再輕輕放下另一側(cè),，以免產(chǎn)生氣泡,，封好的爬片平放置于通風(fēng)廚中晾干,。

11. 鏡檢觀察,。