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細胞屬性：

方法簡介

實驗室分離的大鼠輸卵管上皮采用-膠原酶混合消化法結(jié)合差速貼壁法,，并通過上皮細胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶,。

質(zhì)量檢測

實驗室分離的大鼠輸卵管上皮經(jīng)Cytokeratin-18免疫熒光鑒定,，純度可達90%以上，且不含有HIV-1,、HBV,、HCV、支原體,、細菌,、酵母和真菌等。

細胞簡介：

大鼠輸卵管上皮細胞分離自輸卵管組織,；輸卵管位于子宮底兩側(cè),，包裹在子宮闊韌帶上緣內(nèi)。自子宮兩角分別伸展至左,、右卵巢,，是輸送卵細胞進入子宮的管道，也是卵受精的場所,。輸卵管主要分漏斗部,、壺腹部、峽部和子宮部,，管壁均由粘膜,、肌層和漿膜三層組成。粘膜形成許多縱行而分支的皺襞,，壺腹部的皺襞發(fā)達,，高而多分支，故管腔不規(guī)則,；至子宮部的皺襞漸減少,。粘膜上皮為單層柱狀。由纖毛細胞和分泌細胞組成,。纖毛細胞以漏斗部和壺腹部多,，至峽部和子宮部逐漸減少，纖毛向子宮方向擺動,，使卵移向子宮并阻止病菌進入腹膜腔.分泌細胞表面有微絨毛,，頂部胞質(zhì)內(nèi)有分泌顆粒，其分泌物構(gòu)成輸卵管液,。輸卵管上皮細胞在卵巢雌激素和孕激素的作用下,，隨月經(jīng)周期而有變化,。雌激素促進輸卵管上皮細胞的生長的功能活動，在子宮內(nèi)膜增生晚期（排卵前）,。纖毛細胞變成高柱狀,，纖毛增多，分泌細胞頂部充滿分泌顆粒,，功能旺盛,。至分泌晚期，兩種細胞均變矮,，分泌細胞的分泌顆粒排空,，纖毛細胞的纖毛也減少。

培養(yǎng)信息：

包被條件：鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培養(yǎng)基：含FBS,、生長添加劑,、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：貼壁

細胞形態(tài)：上皮細胞樣

傳代特性：可傳1-2代

消化液：0.25%

培養(yǎng)條件：氣相：空氣,，95%,；CO2，5%

大鼠輸卵管上皮細胞體外培養(yǎng)周期有限,；建議使用配套的專用生長培養(yǎng)基及正確的操作方法來培養(yǎng),，以此保證該細胞的佳培養(yǎng)狀態(tài)。

細胞培養(yǎng)方法：

1,、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶）,，使覆蓋整個瓶或皿,，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后,，顯微鏡下觀察細胞,，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；若細胞還是貼壁,，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中,，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基,；

⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中,。

2,、細胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化,，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻,。

②在1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中,，補加適量培養(yǎng)基,。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞,，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落,，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒,，放入-80℃冰箱,，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。

操作步驟：

1.將無菌的蓋玻片置于細胞培養(yǎng)皿中,，將細胞懸液接種于培養(yǎng)皿中進行細胞爬片,，待細胞長至80%時取出爬片。

2. 用PBS浸洗爬片3次,，4%的多聚甲醛固定爬片15min,，再次用PBS浸洗玻片3次，每次3min,。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min,，使細胞通透。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過氧化氫）,，PBS沖洗3次，每次3min,。

5. 封閉血清室溫孵育20min,，PBS沖洗3次，每次3min,。

6. 細胞特異性一抗孵育：按照抗體說明書稀釋比例稀釋好一抗,，滴加在爬片上，于4°C濕盒中孵育一夜,，PBS沖洗3次,，每次3min,。

7. 二抗孵育：選與一抗對應(yīng)的二抗，按比例稀釋后滴加在爬片上,，37°C濕盒中孵育30min,，PBS沖洗3次，每次3min,。

8. 將爬片周圍水漬吸干,，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察,，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色的陽性信號時用蒸餾水沖洗終止顯色,。

9. 復(fù)染：用Harris蘇木素復(fù)染30s~1min，水洗后用1%的鹽酸酒精分化,，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍,。

10. 封片：將中性樹膠滴在爬片一側(cè)，再用蓋玻片蓋上,，先放平蓋玻片一側(cè)再輕輕放下另一側(cè),，以免產(chǎn)生氣泡，封好的爬片平放置于通風(fēng)廚中晾干,。

11. 鏡檢觀察,。

公司產(chǎn)品：