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細胞屬性：

方法簡介

實驗室分離的大鼠腎臟微血管內皮采用膠原酶消化，結合內皮細胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來,，細胞總量約為5×10?cells/瓶,。

質量檢測

實驗室分離的大鼠腎臟微血管內皮經(jīng)CD31免疫熒光鑒定，純度可達90%以上,，且不含有HIV-1,、HBV、HCV,、支原體,、細菌、酵母和真菌等,。

細胞簡介：

大鼠腎臟微血管內皮細胞分離自腎臟,；腎臟是大鼠的重要器官，它的基本功能是生成尿液,，借以清除體內代謝產(chǎn)物及某些廢物,、毒物,，同時經(jīng)重吸收功能保留水分及其他有用物質，如葡萄糖,、蛋白質,、氨基酸、鈉離子,、鉀離子,、等，以調節(jié)水,、電解質平衡及維護酸堿平衡,。腎臟同時還有內分泌功能，生成腎素,、促紅細胞生成素,、活性維生素D3、前列腺素,、激肽等,，又為機體部分內分泌激素的降解場所和腎外激素的靶器官。腎臟的這些功能,，保證了機體內環(huán)境的穩(wěn)定,，使新陳代謝得以正常進行。腎臟內部的結構,，可分為腎實質和腎盂兩部分,。在腎縱切面可以看到，腎實質分內外兩層：外層為皮質,，內層為髓質,。腎皮質位于腎實質表層，富含血管,，新鮮時呈紅褐色,，由一百多萬個腎單位組成。每個腎單位由腎小體和腎小管所構成,，部分皮質伸展至髓質錐體間,，成為腎柱。腎髓質位于腎皮質的深面,，血管較少,，色淡紅，為10-20個錐體所構成,。腎錐體在切面上呈三角形,。錐體底部向腎凸面，向腎門，錐體主要組織為集合管,，錐體稱腎乳頭,，每一個乳頭有10-20個乳頭管，向腎小盞漏斗部開口,。在腎竇內有腎小盞,，為漏斗形的膜狀小管，圍繞腎乳頭,。腎錐體與腎小盞相連接,。每腎有7-8個腎小盞，相鄰2-3個腎小盞合成一個腎大盞,。每腎有2-3個腎大盞，腎大盞匯合成扁漏斗狀的腎盂,。腎盂出腎門后逐漸縮窄變細,，移行為輸尿管。腎單位是腎臟結構和功能的基本單位,。腎小體包括腎小球和腎小囊,。腎小體內有一個毛細血管團，稱為腎小球,，腎小球是個血管球,。它由腎動脈分支形成,。腎小球外有腎小囊包繞,。腎小囊分兩層，兩層之間有囊腔與腎小管的管腔相通,。腎小管匯成集合管,。若干集合管匯合成乳頭管,，尿液由此流入腎小盞。微血管又稱毛細血管,。分布于各種組織和細胞間的最微細的血管,。介于微動脈和微靜脈之間。平均直徑7-9微米,，數(shù)量極多,，成網(wǎng)狀分布。管壁由一層內皮細胞及一薄層基膜組成,，厚約0.5微米,。基膜外面有薄層結締組織,，其中有纖維細胞,、巨噬細胞和周細胞等。最細的毛細血管由一個內皮細胞圍成管腔，較粗的毛細血管由2-3個內皮細胞圍成,。分布于肌肉組織,、神經(jīng)組織和結締組織中的毛細血管，內皮細胞間為縫隙連接（縫隙寬150埃）,，稱連續(xù)毛細血管,；分布于內分泌腺、腎臟等處的毛細血管,，除有縫隙連接外,，細胞本身有許多小孔，（孔徑800-1000埃）,，稱有孔毛細血管,；分布于肝、脾,、骨髓及某些內分泌腺的毛細血管,，管腔擴大，稱血竇,。毛細血管的管壁薄,、通透性大、管徑細（8-10微米）,、數(shù)量多,、血流速度慢，這些特點使其成為血液與組織液進行物質交換的場所,，又稱交換血管,。血竇（sinusoid）由毛細血管管腔擴大而成，竇壁的一般結構與毛細血管壁相同,，由單層內皮細胞構成,，內皮細胞膜上有窗孔。不同器官的竇壁結構各有差別,。脾血竇的內皮細胞間有較寬裂隙,；肝血竇內皮細胞是不連續(xù)的，有較寬的細胞隙（0.1-0.5微米）,；肝,、脾血竇的基膜不完整或無基膜，通透性比毛細血管大,，較大的蛋白質和血細胞可以通過,。肝血竇壁內有枯否細胞，脾血竇內外有巨噬細胞,，這兩種細胞都有吞噬能力,，可吞噬清除血液中的異物,、細菌等有害物質，是機體單核巨噬細胞系統(tǒng)的重要組成分,。某些內分泌腺的血竇有連續(xù)的基膜,。

培養(yǎng)信息：

包被條件：PLL（0.1mg/ml），明膠（0.1%）

培養(yǎng)基：含FBS,、EGF,、bFGF、IGF,、VEGF,、Heparin、Hydrocortisone,、Penicillin,、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：貼壁

細胞形態(tài)：內皮細胞樣

傳代特性：可傳2-3代

消化液：0.25%

培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%,；CO2,，5%

大鼠腎臟微血管內皮細胞體外培養(yǎng)周期有限；建議使用配套的專用生長培養(yǎng)基及正確的操作方法來培養(yǎng),，以此保證該細胞的優(yōu)良培養(yǎng)狀態(tài)。

細胞培養(yǎng)方法：

1,、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶）,，使覆蓋整個瓶或皿,，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后,，顯微鏡下觀察細胞,，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；若細胞還是貼壁,，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基,；

⑥懸浮細胞直接離心收集,，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2,、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化,，時間1min左右,，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻,，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基,。

3,、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后,，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落,，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,，加1ml凍存液重懸細胞,；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱,，4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存,。

操作步驟：

1.將無菌的蓋玻片置于細胞培養(yǎng)皿中，將細胞懸液接種于培養(yǎng)皿中進行細胞爬片,，待細胞長至80%時取出爬片,。

2. 用PBS浸洗爬片3次，4%的多聚甲醛固定爬片15min,，再次用PBS浸洗玻片3次,，每次3min。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min,，使細胞通透,。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內源性過氧化物酶，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過氧化氫）,，PBS沖洗3次,，每次3min。

5. 封閉血清室溫孵育20min,，PBS沖洗3次,，每次3min。

6. 細胞特異性一抗孵育：按照抗體說明書稀釋比例稀釋好一抗,，滴加在爬片上,，于4°C濕盒中孵育一夜，PBS沖洗3次,，每次3min,。

7. 二抗孵育：選與一抗對應的二抗,，按比例稀釋后滴加在爬片上，37°C濕盒中孵育30min,，PBS沖洗3次,，每次3min。

8. 將爬片周圍水漬吸干,，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液,，顯微鏡下觀察，當出現(xiàn)棕黃色或棕褐色的陽性信號時用蒸餾水沖洗終止顯色,。

9. 復染：用Harris蘇木素復染30s~1min,，水洗后用1%的鹽酸酒精分化，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍,。

10. 封片：將中性樹膠滴在爬片一側,，再用蓋玻片蓋上，先放平蓋玻片一側再輕輕放下另一側,，以免產(chǎn)生氣泡,，封好的爬片平放置于通風廚中晾干。

11. 鏡檢觀察,。

公司產(chǎn)品：