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細胞屬性：

方法簡介

實驗室分離的大鼠脾臟單核采用密度梯度離心法結合差速貼壁法制備而來,，細胞總量約為5×10?cells/瓶。

質量檢測

實驗室分離的大鼠脾臟單核經(jīng)CD14免疫熒光鑒定,，純度可達90%以上,，且不含有HIV-1、HBV,、HCV,、支原體、細菌,、酵母和真菌等,。

細胞簡介：

大鼠脾臟單核細胞分離自脾臟組織；脾臟是機體最大的免疫器官,，占全身淋巴組織總量的25%,，含有大量的淋巴細胞和巨噬細胞,，是機體細胞免疫和體液免疫的中心。位于左季肋區(qū)后外方肋弓深處,，與9－11肋相對,，長軸與第10肋一致。膈面與膈肌和左肋膈竇相鄰,，前方有胃,，后方與左腎、左腎上腺毗鄰,，下端與結腸脾溝相鄰,，地柔軟的網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞器官。單核細胞（monocytes）是體積最大的白細胞,。其細胞核常偏位,，呈多形性，如卵圓形,、腎形(a),、馬蹄形(b),、不規(guī)則形（c）等,，常有折疊感(c)；染色質呈疏松網(wǎng)狀,，著色較淺,。胞質較多，嗜堿性,，但因含大量細小的嗜天青顆粒而染成灰藍色,，顆粒含過氧化物酶。單核細胞是血液中最大的血細胞,。目前認為它是巨噬細胞的前身,，具有明顯的變形運動，能吞噬,、清除受傷,、衰老的細胞及其碎片。單核細胞還參與免疫反應,，在吞噬抗原后將所攜帶的抗原決定簇轉交給淋巴細胞,，誘導淋巴細胞的特異性免性反應。單核細胞也是對付細胞內(nèi)致病細菌和寄生蟲的主要細胞防衛(wèi)系統(tǒng),，還具有識別和殺傷腫瘤細胞的能力,。淋巴細胞則為具有特異性免疫功能的細胞。T淋巴細胞主要參與細胞免疫反應而B淋巴細胞參與體液免疫反應,。

培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基：含FBS,、M-CSF,、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：半貼壁半懸浮

細胞形態(tài)：巨噬細胞樣

傳代特性：不傳代,，不增殖,，存活1-2周

消化液：0.25%

培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%,；CO2,，5%

大鼠脾臟單核細胞體外培養(yǎng)周期有限；建議使用配套的專用生長培養(yǎng)基及正確的操作方法來培養(yǎng),，以此保證該細胞的優(yōu)良培養(yǎng)狀態(tài),。

細胞培養(yǎng)方法：

1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿,，蓋好放入培養(yǎng)箱消化,；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞,，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落,，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；若細胞還是貼壁,，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止,；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中,，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細胞直接離心收集,，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中,。

2、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化,，時間1min左右,，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻,，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基,。

3,、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后,，顯微鏡下觀察細胞,，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞,；

④將凍存管放入程序降溫盒,，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存,。

公司產(chǎn)品：

操作步驟：

1.將無菌的蓋玻片置于細胞培養(yǎng)皿中,，將細胞懸液接種于培養(yǎng)皿中進行細胞爬片，待細胞長至80%時取出爬片,。

2. 用PBS浸洗爬片3次,，4%的多聚甲醛固定爬片15min，再次用PBS浸洗玻片3次,，每次3min,。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min，使細胞通透,。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過氧化氫）,，PBS沖洗3次,，每次3min。

5. 封閉血清室溫孵育20min,，PBS沖洗3次,，每次3min。

6. 細胞特異性一抗孵育：按照抗體說明書稀釋比例稀釋好一抗,，滴加在爬片上,，于4°C濕盒中孵育一夜，PBS沖洗3次,，每次3min,。

7. 二抗孵育：選與一抗對應的二抗，按比例稀釋后滴加在爬片上,，37°C濕盒中孵育30min,，PBS沖洗3次，每次3min,。

8. 將爬片周圍水漬吸干,，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液,，顯微鏡下觀察，當出現(xiàn)棕黃色或棕褐色的陽性信號時用蒸餾水沖洗終止顯色,。

9. 復染：用Harris蘇木素復染30s~1min,，水洗后用1%的鹽酸酒精分化，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍,。

10. 封片：將中性樹膠滴在爬片一側,，再用蓋玻片蓋上，先放平蓋玻片一側再輕輕放下另一側,，以免產(chǎn)生氣泡,，封好的爬片平放置于通風廚中晾干。

11. 鏡檢觀察,。