大鼠胚胎干原代細(xì)胞公司出售的產(chǎn)品：人原代乳腺癌血管內(nèi)皮細(xì)胞 PC-3(人前列腺癌細(xì)胞) HGC-27 人胃癌細(xì)胞（未分化） 1ml/T75 ACTE1 非洲爪蟾胚胎細(xì)胞 MCF-7 人癌細(xì)胞（新） 兔原代尿道平滑肌細(xì)胞

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細(xì)胞屬性：

方法簡(jiǎn)介

公司實(shí)驗(yàn)室分離的大鼠胚胎干采用分離囊胚組織,，去除胚胎透明帶,、使用特制專用培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)，酶消化傳代純化制備而來(lái),，細(xì)胞總量約為5×105cells/瓶,。

質(zhì)量檢測(cè)

公司實(shí)驗(yàn)室分離的大鼠胚胎干經(jīng)Oct-4免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上,，且不含有HIV-1,、HBV、HCV,、支原體,、細(xì)菌、酵母和真菌等,。

 

細(xì)胞簡(jiǎn)介：

大鼠胚胎干細(xì)胞分離自囊胚胚胎組織,；胚胎干細(xì)胞（Embryonic stem cell，ESCs,，簡(jiǎn)稱ES,、EK或ESC細(xì)胞）是早期胚胎（原腸胚期之前）或原始性腺中分離出來(lái)的一類細(xì)胞，它具有體外培養(yǎng)無(wú)限增殖,、自我更新和多向分化的特性,。無(wú)論在體外還是體內(nèi)環(huán)境,，ES細(xì)胞都能被誘導(dǎo)分化為機(jī)體幾乎所有的細(xì)胞類型。進(jìn)一步說(shuō),，胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）是一種高度未分化細(xì)胞,。它具有發(fā)育的全能性，能分化出成體動(dòng)物的所有組織和器官,，包括生殖細(xì)胞,。ES細(xì)胞具有與早期胚胎細(xì)胞相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核大,，有一個(gè)或幾個(gè)核仁,，胞核中多為常染色質(zhì)，胞質(zhì)胞漿少,，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,。體外培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞排列緊密,，呈集落狀生長(zhǎng),。用堿性磷酸酶染色，ES細(xì)胞呈棕紅色,，而周圍的成纖維細(xì)胞呈淡黃色,。細(xì)胞克隆和周圍存在明顯界限，形成的克隆細(xì)胞彼此界限不清,，細(xì)胞表面有折光較強(qiáng)的脂狀小滴,。細(xì)胞克隆形態(tài)多樣，多數(shù)呈島狀或巢狀,。小鼠ES細(xì)胞的直徑7 微米～18 微米,，豬、牛,、羊ES細(xì)胞的顏色較深,，直徑12 微米～18 微米。胚胎干細(xì)胞與普通細(xì)胞有顯著差別,，有其特定的生長(zhǎng)特性和特定的標(biāo)志,，例如堿性磷酸酶活性非常高，帶有胚胎階段特異性表面抗原（ Stage- specific embryonic antigens,SSEA）,，人類胚胎干細(xì)胞還帶有高分子量的糖蛋白TRA1-60,、TRA-1-81等標(biāo)志，這些特性和標(biāo)志均可以用于對(duì)胚胎干細(xì)胞進(jìn)行鑒定,，除此之外,，胚胎干細(xì)胞還可以在體外傳代，并保持正常核型,。在體外培養(yǎng)體系中加入分化抑制劑如白血病抑制因子（ Leukaemia inhibitory factor,LF）或者在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層（MEF）上培養(yǎng)時(shí),，胚胎干細(xì)胞都能呈克隆性增殖,，長(zhǎng)期保持核型正常和穩(wěn)定，凍存解凍也不影響不分化的特性,。另外，胚胎干細(xì)胞還表現(xiàn)岀高水平端粒酶活性,，目前證明端粒酶與細(xì)胞衰老密切相關(guān),，多數(shù)成熟細(xì)胞的端粒酶活性都很低。這些都是胚胎干細(xì)胞與成熟細(xì)胞不同的重要特點(diǎn),，也可能是其復(fù)制生命期限遠(yuǎn)比體細(xì)胞長(zhǎng)的原因,。

培養(yǎng)信息：

包被條件 明膠（0.1%）

培養(yǎng)基 含LIF、BMP,、Penicillin,、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次；

生長(zhǎng)特性 貼壁

細(xì)胞形態(tài) 短梭形,、多角形

傳代特性 可傳5-8代左右

消化液 0.025%

培養(yǎng)條件 氣相：空氣,，95%；CO2,，5%

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1,、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,；

②加入2ml0.25%（T25瓶）,，使覆蓋整個(gè)瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化,；

③1-2min后,，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止,；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中,，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基,；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中,。

2,、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右,，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻,。

②在1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中,，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基,。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞,，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒,，放入-80℃冰箱,，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存。

公司產(chǎn)品：

操作步驟：

1.將無(wú)菌的蓋玻片置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中,，將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞爬片，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)取出爬片,。

2. 用PBS浸洗爬片3次,，4%的多聚甲醛固定爬片15min，再次用PBS浸洗玻片3次,，每次3min,。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min，使細(xì)胞通透,。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過(guò)氧化氫），PBS沖洗3次,，每次3min,。

5. 封閉血清室溫孵育20min，PBS沖洗3次,，每次3min,。

6. 細(xì)胞特異性一抗孵育：按照抗體說(shuō)明書稀釋比例稀釋好一抗，滴加在爬片上,，于4°C濕盒中孵育一夜,，PBS沖洗3次，每次3min,。

7. 二抗孵育：選與一抗對(duì)應(yīng)的二抗,，按比例稀釋后滴加在爬片上,，37°C濕盒中孵育30min，PBS沖洗3次,，每次3min,。

8. 將爬片周圍水漬吸干，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液,，顯微鏡下觀察,，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色的陽(yáng)性信號(hào)時(shí)用蒸餾水沖洗終止顯色。

9. 復(fù)染：用Harris蘇木素復(fù)染30s~1min,，水洗后用1%的鹽酸酒精分化，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍(lán),。

10. 封片：將中性樹(shù)膠滴在爬片一側(cè),，再用蓋玻片蓋上，先放平蓋玻片一側(cè)再輕輕放下另一側(cè),，以免產(chǎn)生氣泡,，封好的爬片平放置于通風(fēng)廚中晾干。

11. 鏡檢觀察,。