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細胞屬性：

方法簡介

實驗室分離的大鼠胚成纖維采用消化法結合差速貼壁法制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶,。

質量檢測

實驗室分離的大鼠胚成纖維經Vimentin免疫熒光鑒定,，純度可達90%以上，且不含有HIV-1,、HBV,、HCV、支原體,、細菌,、酵母和真菌等。

細胞簡介：

大鼠胚成纖維細胞分離自胚胎,；成纖維細胞（Fibroblast）是疏松結締組織的主要細胞成分,，由胚胎時期的間充質細胞分化而來。成纖維細胞較大,，輪廓清楚,，多為突起的紡錘形或星形的扁平狀結構，其細胞核呈規(guī)則的卵圓形,，核仁大而明顯,。成纖維細胞功能活動旺盛，細胞質嗜弱堿性,，具明顯的蛋白質合成和分泌活動,，在一定條件下，它可以實現(xiàn)跟纖維細胞的互相轉化,；成纖維細胞對不同程度的細胞變性、壞死和組織缺損的修復有著十分重要的作用,。剛分離的胚胎成纖維細胞呈圓形,、折光性良好，懸浮于培養(yǎng)基中,。30min細胞貼壁,，其中部分開始伸出偽足，表現(xiàn)為小的突起,；6h后細胞基本貼壁,，伸展成梭形，胞核清晰,，分布較均勻,，散在生長，不聚集成團,；細胞生長迅速,，5-7天即呈融合狀態(tài),，細胞排列緊密，有的交叉重疊生長,，平坦,、胞體較大，細胞質透明,，細胞核較大,，呈橢圓形，顏色淡,。細胞融合,，并彼此連接成網狀；細胞呈突起的紡錘形或星形的扁平分布,。細胞呈突起的紡錘形或星形的扁平分布,。該細胞常用作ES細胞培養(yǎng)常用的飼養(yǎng)層細胞，能產生抑制ES細胞自主分化和促進ES細胞增殖的因子,，故能有效地促進ES細胞的增殖并維持其未分化特性和多潛能性,，且分泌效果優(yōu)于外源添加的一些因子，而且可以為ES細胞的培養(yǎng)提供類似于體內的微環(huán)境,，故在研究哺乳動物ES細胞中得到廣泛使用,。

培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基：含FBS、bFGF,、Insulin,、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：貼壁

細胞形態(tài)：成纖維細胞樣

傳代特性：可傳3代左右

消化液：0.25%

培養(yǎng)條件：氣相：空氣,，95%,；CO2，5%

大鼠胚成纖維細胞體外培養(yǎng)周期有限,；建議使用配套的專用生長培養(yǎng)基及正確的操作方法來培養(yǎng),，以此保證該細胞的優(yōu)良培養(yǎng)狀態(tài)。

細胞培養(yǎng)方法：

1,、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶）,，使覆蓋整個瓶或皿,，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后,，顯微鏡下觀察細胞,，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；若細胞還是貼壁,，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止,；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中,，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細胞直接離心收集,，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中,。

2、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化,，時間1min左右,，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻,，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基,。

3,、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后,，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落,，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,，加1ml凍存液重懸細胞,；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱,，4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存,。

操作步驟：

1.將無菌的蓋玻片置于細胞培養(yǎng)皿中，將細胞懸液接種于培養(yǎng)皿中進行細胞爬片,，待細胞長至80%時取出爬片。

2. 用PBS浸洗爬片3次,，4%的多聚甲醛固定爬片15min,，再次用PBS浸洗玻片3次，每次3min,。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min,，使細胞通透。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內源性過氧化物酶,，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過氧化氫）,，PBS沖洗3次,，每次3min。

5. 封閉血清室溫孵育20min,，PBS沖洗3次,，每次3min。

6. 細胞特異性一抗孵育：按照抗體說明書稀釋比例稀釋好一抗,，滴加在爬片上,，于4°C濕盒中孵育一夜，PBS沖洗3次,，每次3min,。

7. 二抗孵育：選與一抗對應的二抗，按比例稀釋后滴加在爬片上,，37°C濕盒中孵育30min,，PBS沖洗3次，每次3min,。

8. 將爬片周圍水漬吸干,，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察,，當出現(xiàn)棕黃色或棕褐色的陽性信號時用蒸餾水沖洗終止顯色,。

9. 復染：用Harris蘇木素復染30s~1min，水洗后用1%的鹽酸酒精分化,，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍,。

10. 封片：將中性樹膠滴在爬片一側，再用蓋玻片蓋上,，先放平蓋玻片一側再輕輕放下另一側,，以免產生氣泡，封好的爬片平放置于通風廚中晾干,。

11. 鏡檢觀察,。

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