大鼠肌源性干原代細(xì)胞公司出售的產(chǎn)品：大鼠原代羊膜上皮細(xì)胞 HL-60(人早幼粒急性白血病細(xì)胞) NCI-H446 人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞 1ml/T75 MDA-MB-415 人腺癌細(xì)胞 Ca Ski 人腸轉(zhuǎn)移細(xì)胞 小鼠原代肌腱干細(xì)胞

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細(xì)胞屬性：

方法簡(jiǎn)介

公司實(shí)驗(yàn)室分離的大鼠肌源性干采用膠原酶-蛋白酶-聯(lián)合消化法結(jié)合密度梯度離心,、差速貼壁法,，最后通過(guò)肌源性干細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來(lái)，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶,。

質(zhì)量檢測(cè)

公司實(shí)驗(yàn)室分離的大鼠肌源性干經(jīng)Sca-1免疫熒光鑒定,，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1,、HBV,、HCV、支原體,、細(xì)菌,、酵母和真菌等。

 

細(xì)胞簡(jiǎn)介：

大鼠肌源性干細(xì)胞分離自肌肉組織,；肌源性干細(xì)胞（MDSCs）屬于成體多能干細(xì)胞,，具有多細(xì)胞系分化和自我更新能力。通過(guò)誘導(dǎo)刺激,，MDSCs可以分化為脂肪,、骨骼、軟骨,、平滑肌和神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞和組織類型,；作為基因治療和組織工程的供體細(xì)胞，已成為治療心肌梗死,、Duchenne氏肌營(yíng)養(yǎng)不良等疾病的研究熱點(diǎn),；近年來(lái),，肌源性干細(xì)胞在治療尿失禁等方面的應(yīng)用逐步得到重視,。需注意的是，肌源性干細(xì)胞主要存在于骨骼肌組織中,，只是成熟組織的很少部分細(xì)胞,；平時(shí)處于靜止?fàn)顟B(tài)，在細(xì)胞應(yīng)激和組織缺失時(shí)才會(huì)激活,；并且隨著年齡的增加,，所含細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，而目前臨床疾病的治療主要是針對(duì)成體進(jìn)行,。肌源性干細(xì)胞的體外擴(kuò)增對(duì)細(xì)胞移植和干細(xì)胞介導(dǎo)的基因治療至關(guān)重要,。對(duì)肌源性干細(xì)胞的擴(kuò)增研究發(fā)現(xiàn)，EGF、FGF-2和SCF可以通過(guò)減數(shù)分裂或促使不分裂細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂周期,，從而刺激細(xì)胞增生,。更重要的是，細(xì)胞因子誘導(dǎo)的體外擴(kuò)增可以通過(guò)自我更新不刺激細(xì)胞分化,，從而保持干細(xì)胞表型,。

培養(yǎng)信息：

包被條件 PLL（0.1mg/ml）

培養(yǎng)基 含FBS、生長(zhǎng)添加劑,、Penicillin,、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長(zhǎng)特性 貼壁

細(xì)胞形態(tài) 梭形、多角形

傳代特性 可傳5代左右,；3代以內(nèi)狀態(tài)最佳

消化液 0.25%

培養(yǎng)條件 氣相：空氣,，95%；CO2,，5%

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1,、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,；

②加入2ml0.25%（T25瓶）,，使覆蓋整個(gè)瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化,；

③1-2min后,，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止,；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中,，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基,；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中,。

2,、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右,，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻,。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻,，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中,，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基,。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞,，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒,，放入-80℃冰箱,，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存。

公司產(chǎn)品：

1.將無(wú)菌的蓋玻片置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中,，將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞爬片,，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)取出爬片。

2. 用PBS浸洗爬片3次,，4%的多聚甲醛固定爬片15min,，再次用PBS浸洗玻片3次，每次3min,。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min,，使細(xì)胞通透。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過(guò)氧化氫）,，PBS沖洗3次，每次3min,。

5. 封閉血清室溫孵育20min,，PBS沖洗3次，每次3min,。

6. 細(xì)胞特異性一抗孵育：按照抗體說(shuō)明書稀釋比例稀釋好一抗,，滴加在爬片上，于4°C濕盒中孵育一夜,，PBS沖洗3次,，每次3min。

7. 二抗孵育：選與一抗對(duì)應(yīng)的二抗,，按比例稀釋后滴加在爬片上，37°C濕盒中孵育30min,，PBS沖洗3次,，每次3min,。

8. 將爬片周圍水漬吸干，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液,，顯微鏡下觀察,，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色的陽(yáng)性信號(hào)時(shí)用蒸餾水沖洗終止顯色。

9. 復(fù)染：用Harris蘇木素復(fù)染30s~1min,，水洗后用1%的鹽酸酒精分化,，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍(lán)。

10. 封片：將中性樹膠滴在爬片一側(cè),，再用蓋玻片蓋上,，先放平蓋玻片一側(cè)再輕輕放下另一側(cè)，以免產(chǎn)生氣泡,，封好的爬片平放置于通風(fēng)廚中晾干,。

11. 鏡檢觀察。