大鼠股骨頭微血管內(nèi)皮原代細(xì)胞公司出售的產(chǎn)品：大鼠原代三叉神經(jīng)元細(xì)胞 CoC1/DDP(人耐藥細(xì)胞亞株) A-375 人惡性黑色素瘤細(xì)胞 1ml/T75 HPB-ALL（懸浮） T細(xì)胞白血病 Jurkat 人T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞 小鼠原代神經(jīng)少突膠質(zhì)細(xì)胞

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細(xì)胞屬性：

方法簡(jiǎn)介

實(shí)驗(yàn)室分離的大鼠股骨頭微血管內(nèi)皮采用混合膠原酶消化制備而來(lái)，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶,。

質(zhì)量檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)室分離的大鼠股骨頭微血管內(nèi)皮經(jīng)CD31免疫熒光鑒定,，細(xì)胞純度可達(dá)90%以上,，且不含有HIV-1、 HBV,、HCV,、支原體、細(xì)菌,、酵母和真菌等,。

 

細(xì)胞簡(jiǎn)介：

大鼠股骨頭微血管內(nèi)皮細(xì)胞分離自骨組織；股骨頭（caput femoris）呈圓形,，約占一圓球的2/3,，其上為關(guān)節(jié)軟骨所覆蓋，在其頂部微后有一小窩,，稱為股骨頭凹,，為股骨頭韌帶附著處，股骨頭可由此獲得少量血供,。股骨頭骨髓的微血管結(jié)構(gòu)為珊瑚狀,，后毛細(xì)血管微動(dòng)脈與微靜脈部分膨大、迂曲,、互相纏繞,；骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成了骨內(nèi)微血管的內(nèi)襯，與骨內(nèi)其他成分聯(lián)系密切,，參與了許多骨的病理生理過(guò)程在骨吸收新骨的形成血管再生營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)骨內(nèi)代謝產(chǎn)物輸出及維持骨內(nèi)微環(huán)境平衡方面具有重要作用,。

培養(yǎng)信息：

包被條件：PLL（0.1mg/ml），明膠（0.1%）

培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基,，含FBS,、EGF、bFGF,、IGF,、VEGF、Heparin,、Hydrocortisone,、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長(zhǎng)特性：貼壁

細(xì)胞形態(tài)：內(nèi)皮細(xì)胞樣

傳代特性：可傳1-3代左右,；2代以內(nèi)狀態(tài)最佳

消化液：0.25%,，Accutase

培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%,；CO2,，5%

大鼠股骨頭微血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)周期有限；建議使用配套的專用生長(zhǎng)培養(yǎng)基及正確的操作方法來(lái)培養(yǎng)，以此保證該細(xì)胞的最佳培養(yǎng)狀態(tài),。

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1,、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,；

②加入2ml0.25%（T25瓶）,，使覆蓋整個(gè)瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化,；

③1-2min后,，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止,；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中,，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基,；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中,。

2,、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右,，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻,。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻,，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基,。

3,、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后,，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,，加1ml凍存液重懸細(xì)胞,；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存,。

公司產(chǎn)品：

操作步驟：

1.將無(wú)菌的蓋玻片置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞爬片,，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)取出爬片,。

2. 用PBS浸洗爬片3次，4%的多聚甲醛固定爬片15min,，再次用PBS浸洗玻片3次,，每次3min。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min,，使細(xì)胞通透,。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過(guò)氧化氫）,，PBS沖洗3次,，每次3min。

5. 封閉血清室溫孵育20min,，PBS沖洗3次,，每次3min。

6. 細(xì)胞特異性一抗孵育：按照抗體說(shuō)明書(shū)稀釋比例稀釋好一抗,，滴加在爬片上,，于4°C濕盒中孵育一夜，PBS沖洗3次,，每次3min,。

7. 二抗孵育：選與一抗對(duì)應(yīng)的二抗，按比例稀釋后滴加在爬片上,，37°C濕盒中孵育30min,，PBS沖洗3次，每次3min,。

8. 將爬片周圍水漬吸干,，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察,，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色的陽(yáng)性信號(hào)時(shí)用蒸餾水沖洗終止顯色,。

9. 復(fù)染：用Harris蘇木素復(fù)染30s~1min，水洗后用1%的鹽酸酒精分化,，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍(lán),。

10. 封片：將中性樹(shù)膠滴在爬片一側(cè)，再用蓋玻片蓋上,，先放平蓋玻片一側(cè)再輕輕放下另一側(cè),，以免產(chǎn)生氣泡，封好的爬片平放置于通風(fēng)廚中晾干。

11. 鏡檢觀察,。