大鼠肝枯否原代細(xì)胞公司出售的產(chǎn)品：大鼠原代胚胎肝母細(xì)胞 Caov-3(人乳突狀腺癌細(xì)胞) SW579 人甲狀腺鱗癌細(xì)胞 1ml/T75 HeLa 人細(xì)胞 MSTO-211H 人肺癌細(xì)胞株 小鼠原代視乳頭星形膠質(zhì)細(xì)胞

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細(xì)胞屬性：

方法簡(jiǎn)介

公司實(shí)驗(yàn)室分離的大鼠肝枯否采用混合酶灌流消化、低速離心,、密度梯度離心,、差速貼壁法制備而來(lái)，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶,。

質(zhì)量檢測(cè)

公司實(shí)驗(yàn)室分離的大鼠肝枯否經(jīng)CD68免疫熒光鑒定,，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1,、HBV,、HCV、支原體,、細(xì)菌,、酵母和真菌等。

 

細(xì)胞簡(jiǎn)介：

大鼠枯否細(xì)胞分離自肝臟組織,；肝臟是身體內(nèi)以代謝功能為主的一個(gè)器官,，并在身體里面起著去氧化、儲(chǔ)存肝糖,、分泌性蛋白質(zhì)的合成等作用,；肝臟也制造消化系統(tǒng)中之膽汁。肝臟是機(jī)體內(nèi)臟里最大的器官，位于機(jī)體中的腹部位置,，在右側(cè)橫隔膜之下,，位于膽囊之前端且于右邊腎臟的前方，胃的上方,。肝臟是機(jī)體消化系統(tǒng)中最大的消化腺,，為一紅棕色的V字形器官。肝臟是尿素合成的主要器官,，又是新陳代謝的重要器官,。肝臟在機(jī)體位置和形態(tài)結(jié)構(gòu)：肝臟位于右上腹，隱藏在右側(cè)膈下和肋骨深面,，大部分肝為肋弓所復(fù)蓋,，僅在腹上區(qū)、右肋弓間露出并直接接觸腹前壁,，肝上面則與膈及腹前壁相接,。枯否氏細(xì)胞(Kupffer細(xì)胞)是肝臟的肝血竇內(nèi)一些固定于竇壁的巨噬細(xì)胞,，它能吞噬和清除大部分從腸道來(lái)的抗原微粒,，并能吞噬和清除肝血竇中的細(xì)菌、異物和衰老的紅細(xì)胞,，并把血紅蛋白分解成,。此外，肝巨噬細(xì)胞也有處理抗原,，誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖,，參與免疫調(diào)節(jié)的作用?？莘袷霞?xì)胞和一般巨噬細(xì)胞不同,，枯否氏細(xì)胞不具有增加抗原免疫原性的能力，相反有消除或減弱抗原性的作用,?？莘袷霞?xì)胞能吞噬來(lái)自血液循環(huán)的抗原抗體復(fù)合物和其他有害物質(zhì)，以消除這些物質(zhì)對(duì)機(jī)體的損害,?？莘窦?xì)胞功能障礙可導(dǎo)致腸源性內(nèi)毒素血癥。電鏡下有很多皺褶和微絨毛,。

培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基 含FBS、生長(zhǎng)添加劑,、Penicillin,、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長(zhǎng)特性 貼壁

細(xì)胞形態(tài) 梭形,、巨噬細(xì)胞

傳代特性 屬于終末分化細(xì)胞；屬于不增殖細(xì)胞群

消化液 （12mM）

培養(yǎng)條件 氣相：空氣,，95%,；CO2，5%

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1,、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶）,，使覆蓋整個(gè)瓶或皿,，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后,，顯微鏡下觀察細(xì)胞,，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；若細(xì)胞還是貼壁,，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中,，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基,；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中,。

2,、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右,，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中,，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3,、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞,，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,，加1ml凍存液重懸細(xì)胞,；

④將凍存管放入程序降溫盒,，放入-80℃冰箱，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存,。

操作步驟：

1.將無(wú)菌的蓋玻片置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中,，將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞爬片，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)取出爬片,。

2. 用PBS浸洗爬片3次,，4%的多聚甲醛固定爬片15min，再次用PBS浸洗玻片3次,，每次3min,。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min，使細(xì)胞通透,。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過(guò)氧化氫），PBS沖洗3次,，每次3min,。

5. 封閉血清室溫孵育20min，PBS沖洗3次,，每次3min,。

6. 細(xì)胞特異性一抗孵育：按照抗體說(shuō)明書(shū)稀釋比例稀釋好一抗，滴加在爬片上,，于4°C濕盒中孵育一夜,，PBS沖洗3次，每次3min,。

7. 二抗孵育：選與一抗對(duì)應(yīng)的二抗,，按比例稀釋后滴加在爬片上，37°C濕盒中孵育30min,，PBS沖洗3次,，每次3min。

8. 將爬片周圍水漬吸干,，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液,，顯微鏡下觀察,，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色的陽(yáng)性信號(hào)時(shí)用蒸餾水沖洗終止顯色。

9. 復(fù)染：用Harris蘇木素復(fù)染30s~1min,，水洗后用1%的鹽酸酒精分化,，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍(lán)。

10. 封片：將中性樹(shù)膠滴在爬片一側(cè),，再用蓋玻片蓋上,，先放平蓋玻片一側(cè)再輕輕放下另一側(cè)，以免產(chǎn)生氣泡,，封好的爬片平放置于通風(fēng)廚中晾干,。

11. 鏡檢觀察。

公司產(chǎn)品：