大鼠肝竇內(nèi)皮原代細(xì)胞公司出售的產(chǎn)品：大鼠原代尿道上皮細(xì)胞 Calu-1(人肺癌細(xì)胞) BT-549 人導(dǎo)管癌細(xì)胞 1ml/T75 HEC-1-B 人內(nèi)膜腺癌細(xì)胞 U87-GFP 人腦膠質(zhì)瘤綠色熒光細(xì)胞 小鼠原代視網(wǎng)膜前體細(xì)胞

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細(xì)胞屬性：

方法簡介

公司實驗室分離的大鼠肝竇內(nèi)皮采用混合酶灌流消化,、反復(fù)低速離心、密度梯度離心法,，并通過內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來,，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。

質(zhì)量檢測

公司實驗室分離的大鼠肝竇內(nèi)皮經(jīng)CD31,、CD14免疫熒光鑒定,，純度可達90%以上,，且不含有HIV-1、HBV,、HCV,、支原體、細(xì)菌,、酵母和真菌等,。

 

細(xì)胞簡介：

大鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞分離自肝臟組織；肝臟是身體內(nèi)以代謝功能為主的一個器官,，并在身體里面起著去氧化,、儲存肝糖、分泌性蛋白質(zhì)的合成等作用,；肝臟也制造消化系統(tǒng)中之膽汁,。肝臟是機體內(nèi)臟里最大的器官，位于機體中的腹部位置,，在右側(cè)橫隔膜之下,，位于膽囊之前端且于右邊腎臟的前方，胃的上方,。肝臟是機體消化系統(tǒng)中最大的消化腺,，為一紅棕色的V字形器官。肝臟是尿素合成的主要器官,，又是新陳代謝的重要器官,。肝臟在機體位置和形態(tài)結(jié)構(gòu)：肝臟位于右上腹，隱藏在右側(cè)膈下和肋骨深面,，大部分肝為肋弓所復(fù)蓋,，僅在腹上區(qū)、右肋弓間露出并直接接觸腹前壁,，肝上面則與膈及腹前壁相接,。肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（SEC）是肝臟內(nèi)所占比例最高的非實質(zhì)細(xì)胞，位于肝竇腔與肝細(xì)胞之間,，具有物質(zhì)轉(zhuǎn)運,、吞噬、抗原提呈,、免疫耐受等功能,。SEC由于擁有一般細(xì)胞所沒有的窗孔結(jié)構(gòu)、細(xì)胞間連結(jié)松散,、內(nèi)皮下缺少基底膜而使其具有高度通透性,，從而達到快速交換各種大小分子的目的,。肝在遭到多種病原侵襲時,，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞窗孔逐漸減少或消失,，內(nèi)皮下基膜形成，產(chǎn)生類似于連續(xù)型毛細(xì)血管的結(jié)構(gòu),，這一過程稱為肝竇毛細(xì)血管化,。它由多種因素引起，其過程極復(fù)雜,，在多種肝病的發(fā)病前期階段均有出現(xiàn),，近年來受到廣泛關(guān)注。

培養(yǎng)信息：

包被條件 PLL（0.1mg/ml）,，明膠（0.1%）

培養(yǎng)基 含FBS,、生長添加劑、Penicillin,、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細(xì)胞形態(tài) 內(nèi)皮細(xì)胞樣

傳代特性 可傳1-2代

消化液 0.25%

培養(yǎng)條件 氣相：空氣,，95%；CO2,，5%

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1,、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,；

②加入2ml0.25%（T25瓶）,，使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化,；

③1-2min后,，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止,；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中,，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基,；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中,。

2,、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右,，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻,。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻,，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中,，補加適量培養(yǎng)基,。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時進行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞,，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒,，放入-80℃冰箱,，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。

公司產(chǎn)品：

操作步驟：

1.將無菌的蓋玻片置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中,，將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中進行細(xì)胞爬片,，待細(xì)胞長至80%時取出爬片。

2. 用PBS浸洗爬片3次,，4%的多聚甲醛固定爬片15min,，再次用PBS浸洗玻片3次，每次3min,。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min,，使細(xì)胞通透。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過氧化氫）,，PBS沖洗3次，每次3min,。

5. 封閉血清室溫孵育20min,，PBS沖洗3次，每次3min,。

6. 細(xì)胞特異性一抗孵育：按照抗體說明書稀釋比例稀釋好一抗,，滴加在爬片上，于4°C濕盒中孵育一夜,，PBS沖洗3次,，每次3min。

7. 二抗孵育：選與一抗對應(yīng)的二抗,，按比例稀釋后滴加在爬片上,，37°C濕盒中孵育30min，PBS沖洗3次,，每次3min,。

8. 將爬片周圍水漬吸干,，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察,，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色的陽性信號時用蒸餾水沖洗終止顯色。

9. 復(fù)染：用Harris蘇木素復(fù)染30s~1min,，水洗后用1%的鹽酸酒精分化,，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍。

10. 封片：將中性樹膠滴在爬片一側(cè),，再用蓋玻片蓋上,，先放平蓋玻片一側(cè)再輕輕放下另一側(cè)，以免產(chǎn)生氣泡,，封好的爬片平放置于通風(fēng)廚中晾干,。

11. 鏡檢觀察。