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細胞屬性：

方法簡介

公司實驗室分離的大鼠多巴胺神經(jīng)元采用消化法,、神經(jīng)元專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選結(jié)合化學(xué)試劑抑制法制備而來,，細胞總量約為5×10?cells/瓶。

質(zhì)量檢測

公司實驗室分離的大鼠多巴胺神經(jīng)元經(jīng)TH免疫熒光鑒定,，純度可達90%以上,，且不含有HIV-1、HBV,、HCV,、支原體、細菌,、酵母和真菌等,。

細胞簡介：

大鼠多巴胺神經(jīng)元細胞分離腦組織；多巴胺神經(jīng)元,，即：胺能神經(jīng)元,，主要指含多巴胺的神經(jīng)元，其細胞體主要分布在黑質(zhì)、腳間核和丘腦下部等處,。在這些區(qū)域多巴胺含量很高,。多巴胺在機體內(nèi)合成時以為原料。腦內(nèi)的多巴胺主要是由黑質(zhì)細胞來合成,，這些多巴胺參與錐體外系統(tǒng)的活動,，與軀體運動機能有密切關(guān)系。腦內(nèi)多巴胺代謝失常時,，可引起震顫性麻痹(帕金森震顫),。多巴胺(Dopamine)，是NA的前體物質(zhì),，是下丘腦和腦垂體腺中的一種關(guān)鍵神經(jīng)遞質(zhì),，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中多巴胺的濃度受精神因素的影響，神經(jīng)末梢的GnRH和多巴胺間存在著軸突聯(lián)系并相互作用,，以及多巴胺有抑制GnRH分泌的作用,。中腦的神經(jīng)原物質(zhì)多巴胺(Dopamine)，則直接影響人們的情緒,。從理論上來看,，增加這種物質(zhì)，就能讓人興奮,，但是它會令人上癮,。多巴胺在前腦和基底神經(jīng)節(jié)(Basal Ganglia)出現(xiàn)，基底神經(jīng)節(jié)負責(zé)處理恐懼的情緒,，但由于多巴胺的緣故,，取代了恐懼的感覺，因此有很多人的上癮行為,，都是因多巴胺而起的,。

培養(yǎng)信息：

包被條件 PLL（0.1mg/ml）

培養(yǎng)基 含B-27 Supplement、Penicillin,、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細胞形態(tài) 神經(jīng)元細胞樣

傳代特性 屬于終末分化細胞,；屬于不增殖細胞群

消化液 0.25%

培養(yǎng)條件 氣相：空氣，95%,；CO2，5%

細胞培養(yǎng)方法：

1,、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶）,，使覆蓋整個瓶或皿,，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后,，顯微鏡下觀察細胞,，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落,，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；若細胞還是貼壁,，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止,；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中,，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細胞直接離心收集,，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中,。

2、細胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化,，時間1min左右,，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻,，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基,。

3,、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后,，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落,，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,，加1ml凍存液重懸細胞,；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱,，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存,。

公司產(chǎn)品：

1.將無菌的蓋玻片置于細胞培養(yǎng)皿中,，將細胞懸液接種于培養(yǎng)皿中進行細胞爬片，待細胞長至80%時取出爬片,。

2. 用PBS浸洗爬片3次,，4%的多聚甲醛固定爬片15min，再次用PBS浸洗玻片3次，每次3min,。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min,，使細胞通透。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過氧化氫）,，PBS沖洗3次，每次3min,。

5. 封閉血清室溫孵育20min,，PBS沖洗3次，每次3min,。

6. 細胞特異性一抗孵育：按照抗體說明書稀釋比例稀釋好一抗,，滴加在爬片上，于4°C濕盒中孵育一夜,，PBS沖洗3次,，每次3min。

7. 二抗孵育：選與一抗對應(yīng)的二抗,，按比例稀釋后滴加在爬片上,，37°C濕盒中孵育30min，PBS沖洗3次,，每次3min,。

8. 將爬片周圍水漬吸干，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液,，顯微鏡下觀察,，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色的陽性信號時用蒸餾水沖洗終止顯色。

9. 復(fù)染：用Harris蘇木素復(fù)染30s~1min,，水洗后用1%的鹽酸酒精分化,，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍。

10. 封片：將中性樹膠滴在爬片一側(cè),，再用蓋玻片蓋上,，先放平蓋玻片一側(cè)再輕輕放下另一側(cè)，以免產(chǎn)生氣泡,，封好的爬片平放置于通風(fēng)廚中晾干,。

11. 鏡檢觀察。