大鼠Ⅱ型肺泡上皮原代細(xì)胞公司出售的產(chǎn)品：大鼠原代背根神經(jīng)元細(xì)胞 彈性蛋白酶(含100mL酶解緩沖液) 10mL 神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞 A549 肺腺癌 Hela, 人細(xì)胞系 Human 豬原代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞

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細(xì)胞屬性：

方法簡介

公司實驗室分離的大鼠Ⅱ型肺泡上皮采用彈性蛋白酶灌注消化法結(jié)合差速貼壁法,，并通過上皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來,，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。

質(zhì)量檢測

公司實驗室分離的大鼠Ⅱ型肺泡上皮經(jīng)SP-C免疫熒光鑒定,，純度可達90%以上,，且不含有HIV-1、HBV,、HCV,、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等,。

 細(xì)胞簡介：

大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞分離自肺組織,；肺泡由單層上皮細(xì)胞構(gòu)成的半球狀囊泡。肺中的支氣管經(jīng)多次反復(fù)分枝成無數(shù)細(xì)支氣管,，它們的末端膨大成囊,，囊的四周有很多突出的小囊泡，即為肺泡,。小肺泡細(xì)胞,，又稱I型肺泡細(xì)胞,，厚約0.1微米,，基底部是基底膜，無增殖能力,。大肺泡細(xì)胞,，又稱Ⅱ型肺泡細(xì)胞，分泌表面活性物質(zhì)（二棕櫚酰）,，以降低肺泡表面張力,。Ⅱ型肺泡細(xì)胞位于Ⅰ型肺泡細(xì)胞之間，數(shù)量較Ⅰ型肺泡細(xì)胞多,，但覆蓋面積比Ⅰ型肺泡細(xì)胞小,。細(xì)胞立方形或圓形,頂端突入肺泡腔。細(xì)胞核圓形,，胞質(zhì)著色淺,、呈泡沫狀。電鏡下,，細(xì)胞游離而有少量微絨毛,，胞質(zhì)內(nèi)富含線粒體和溶酶體，有較發(fā)達的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體,。核上方有較多的分泌顆粒,，電子密度高、大小不等,，直徑約0.1-1.0μm顆粒內(nèi)含有平行排列的板層狀結(jié)構(gòu),，稱為嗜餓性板層小體。小體內(nèi)的主要成分為磷脂,，以二棕櫚酰為主,，此外還有糖胺多糖及蛋白質(zhì)等。顆粒內(nèi)物質(zhì)釋放出來后,，在肺泡表面形成一層粘液層,，稱為表面活性物質(zhì)（surfactant）。表面活性物質(zhì)有降低肺泡表面張力、穩(wěn)定肺泡大小的作用,。呼氣時肺泡縮小,，表面活性物質(zhì)密度增加，表面張力降低,，防止肺泡過度塌陷,；吸氣時肺泡擴張，表面活性物質(zhì)密度減小,，肺泡回縮力加大,，可防止肺泡過度膨脹。表面活性物質(zhì)的缺乏或變性均可引起肺不張,，過度通氣可造成表面活性物質(zhì)缺乏,；吸入毒氣可直接破壞表面活性物質(zhì)。Ⅱ型肺泡細(xì)胞有分裂,、增殖并分化為Ⅰ型肺泡細(xì)胞的潛能,，故具有修復(fù)受損傷上皮的作用。

培養(yǎng)信息：

包被條件 鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培養(yǎng)基 含FBS,、生長添加劑,、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細(xì)胞形態(tài) 上皮細(xì)胞樣

傳代特性 可傳1-2代

消化液 0.25%

培養(yǎng)條件 氣相：空氣,，95%,；CO2，5%

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1,、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶）,，使覆蓋整個瓶或皿,，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后,，顯微鏡下觀察細(xì)胞,，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；若細(xì)胞還是貼壁,，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基,；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集,，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中,。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化,，時間1min左右,，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻,，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基,。

3,、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時進行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后,，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒,，放入-80℃冰箱,，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。

操作步驟：

1.將無菌的蓋玻片置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中,，將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中進行細(xì)胞爬片,，待細(xì)胞長至80%時取出爬片。

2. 用PBS浸洗爬片3次,，4%的多聚甲醛固定爬片15min,，再次用PBS浸洗玻片3次，每次3min,。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min,，使細(xì)胞通透。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過氧化氫）,，PBS沖洗3次，每次3min,。

5. 封閉血清室溫孵育20min,，PBS沖洗3次，每次3min,。

6. 細(xì)胞特異性一抗孵育：按照抗體說明書稀釋比例稀釋好一抗,，滴加在爬片上,，于4°C濕盒中孵育一夜，PBS沖洗3次,，每次3min,。

7. 二抗孵育：選與一抗對應(yīng)的二抗，按比例稀釋后滴加在爬片上,，37°C濕盒中孵育30min,，PBS沖洗3次，每次3min,。

8. 將爬片周圍水漬吸干,，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察,，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色的陽性信號時用蒸餾水沖洗終止顯色,。

9. 復(fù)染：用Harris蘇木素復(fù)染30s~1min，水洗后用1%的鹽酸酒精分化,，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍(lán),。

10. 封片：將中性樹膠滴在爬片一側(cè)，再用蓋玻片蓋上,，先放平蓋玻片一側(cè)再輕輕放下另一側(cè),，以免產(chǎn)生氣泡，封好的爬片平放置于通風(fēng)廚中晾干,。

11. 鏡檢觀察,。

公司產(chǎn)品：