CTLL-2;小鼠T淋巴細胞是T25直接發(fā)貨的形式。收到細胞后,，拆開包裝T25瓶的自封袋,，不拆封口膜，表面噴75%酒精消毒后顯微鏡觀察細胞狀態(tài)（有條件可以拍下此時細胞照片）,。將細胞放入37度培養(yǎng)箱平衡兩小時以上,，再處理細胞。首先將T25中培養(yǎng)基取出裝好備用,，如細胞密度高于80%，可以直接消化傳代,，相反則加入5-6mL培養(yǎng)基放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)即可,。

1、細胞名稱：CTLL-2;小鼠T淋巴細胞

2,、生長特性：    □ 貼壁   （貼壁不牢容易脫落,，消化無需胰酶請謹慎操作。）

3,、細胞生長條件：

培養(yǎng)條件	90%DMEM（高糖）+10%FBS+1%P/S
溫度	37℃
空氣條件	5% CO2,100% AIR
傳代方法	1:2傳代,，2~3天換液
凍存條件	90%FBS+10%DMSO

4.CTLL-2;小鼠T淋巴細胞背景資料：我們推薦使用AAV-293細胞株繁殖腺病毒相關重組病毒。 AAV-293源自普遍使用的 HEK293細胞株,，但產生的病毒滴度更高,。 HEK293細胞是剪切過的腺病毒5型DNA轉染的人胚腎細胞。 跟HEK293細胞一樣,，AAV-293細胞反式表達腺病毒E1基因,，當共轉染三個AAV助質粒(一個含ITR的質粒，pAAV-RC, 和E1缺失助質粒)時,，可以產生有感染力的腺病毒-相關病毒顆粒,。

二．使用方法

1,、您收到細胞后，請按照以下方法進行操作：

取出25cm²培養(yǎng)瓶,，75%酒精擦拭培養(yǎng)瓶,，拆下封口膜，放入37℃,，5%CO₂細胞培養(yǎng)箱中靜置3-4小時以穩(wěn)定細胞狀態(tài),，然后換用新鮮*培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)或進行傳代。

 

2,、細胞傳代：

1）細胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時,，棄25cm²培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細胞一次,；

2）用5-6ml*培養(yǎng)基輕輕吹打細胞使之脫落,，然后將懸液轉移至15ml離心管中，1000rpm離心5min,；

3）棄上清,，沉淀細胞用12ml*培養(yǎng)基重懸，然后按1:2比例進行分瓶傳代,，zui后放入37℃,，5%CO₂細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4）待細胞*貼壁后,，觀察培養(yǎng)結果,，之后進行換液培養(yǎng)或傳代。

3,、細胞凍存：

1）細胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時,，棄25cm²培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細胞一次,；

2）添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中,，倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后加入*培養(yǎng)液終止消化,，輕輕吹打細胞使之脫落,，然后將懸液轉移至15ml離心管中，1000rpm離心5min,；

3）用適量的凍存液（FBS：DMSO=9 ：1）重懸細胞,，并放置于凍存管中；

4）先將細胞凍存管放置于-20℃ 1.5h,，然后將其移入-80℃過夜,，24h后轉入液氮中進行長期保存。使用程序降溫盒可直接放入-80℃,。 

4,、細胞復蘇：
1）從液氮中取出細胞凍存管（注意：佩戴防爆管面具）,，快速將其置入37℃水浴中解凍，直至凍存管中無結晶,，然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁,；
2）將凍存管中的細胞移至含5ml*培養(yǎng)基的15ml離心管中， 1000rpm離心5min,；

3）棄上清,，沉淀用5ml*培養(yǎng)基重懸，接種25cm²培養(yǎng)瓶,，于37℃,，5%CO₂細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4）第二天,，換用新鮮*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),。

T25瓶處理方法

收到后，檢查外包裝是否完整,，細胞培養(yǎng)瓶是否完好,。如有破損漏液等問題，請即時,。并進行以下操作：

1. 75%酒精棉球擦拭T25細胞培養(yǎng)瓶外部,。

2. 將細胞放入37度培養(yǎng)箱中預溫3-4小時后再做處理，以穩(wěn)定細胞狀態(tài),。

3. 預熱培養(yǎng)基（含10%胎牛血清,，1%雙抗）。

4. 顯微鏡觀察細胞生長情況,，并對細胞進行不同倍數拍照保存（40×,100×,200×各一張）,。

5. ①若細胞密度較小，無菌操作,，去掉培養(yǎng)基。每瓶添加第四步中準備的5-6ml培養(yǎng)基,。放到37度培養(yǎng)箱培養(yǎng),。待細胞密度達到80%以上，進行傳代,。

②若細胞密度較大,，達到80%以上，將細胞傳代培養(yǎng),。

注：

培養(yǎng)瓶里的培養(yǎng)基血清濃度為5%,，建議更換成自己配好的新鮮培養(yǎng)基。由于運輸過程中的問題,，細胞培養(yǎng)瓶中的貼壁細胞有可能從瓶壁中脫落下來,，顯微鏡下觀察會出現細胞懸浮的情況,，這時請在拍照后將懸浮的細胞即時離心，加15%血清的*培養(yǎng)基到新的培養(yǎng)皿/瓶繼續(xù)培養(yǎng)3天,；同時原培養(yǎng)瓶中剩下的貼壁細胞更換為15%血清的*培養(yǎng)基,。（這里是針對原來*培養(yǎng)基FBS濃度是10%的情況，如果原來FBS濃度是20%,，可以增加到25%FBS濃度）   收到細胞后如細胞狀態(tài)不佳或培養(yǎng)中遇到問題,，煩請當天盡快并提供圖片，以便售后處理,。7天內反饋,，本身問題免費重發(fā)如人為原因導致可根據實際情況酌情處理；7天內未接到任何反饋視為合格,，不予免費售后