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小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞RAW264.7培養(yǎng)說(shuō)明書

一,、細(xì)胞培養(yǎng)條件

二,、細(xì)胞收到后處理

培養(yǎng)至良好狀態(tài)后灌滿*培養(yǎng)液并封好瓶口是運(yùn)輸細(xì)胞的最好辦法。收到細(xì)胞用75%酒精噴灑整個(gè)細(xì)胞瓶,，消毒后放到超凈臺(tái)內(nèi)嚴(yán)格無(wú)菌操作,，將細(xì)胞瓶放入37℃、5%CO₂的培養(yǎng)箱中靜置3-4小時(shí)以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)后再做處理,。顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照保存（最好40x,100x,200x各一張），前三天照片是重要售后依據(jù),，不提供照片默認(rèn)收到狀態(tài)良好,。（注意密封培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱時(shí)要將蓋子擰松,，傳代后建議一瓶用原瓶的*培養(yǎng)基，另外一瓶用自己配的*培養(yǎng)基,，以便進(jìn)行對(duì)比培養(yǎng)）

三,、細(xì)胞培養(yǎng)步驟

a、細(xì)胞傳代：如果未超過(guò)80%匯合度時(shí),，將瓶裝的*培養(yǎng)液收集至離心管中,，留5ml*培養(yǎng)基，放入37℃,、5%CO₂孵箱培養(yǎng),；如果細(xì)胞密度超80%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng),，傳代具體步驟如下：

1. 棄去培養(yǎng)上清,，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次,。

2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液約1-2ml至培養(yǎng)瓶中,，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,，若細(xì)胞大部分變圓并脫落,，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上*培養(yǎng)基終止消化,。

3.輕輕吹打細(xì)胞,，使之*脫落后吸出，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中,，在1000RPM條件下離心5分鐘,，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL*培養(yǎng)基重懸,。

4. 將細(xì)胞懸液按1：2的比例進(jìn)行分瓶傳代（兩個(gè)T25瓶）,，補(bǔ)充新的*培養(yǎng)基至5-8ml/瓶，最后放入到37℃,、5%CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

b,、細(xì)胞凍存：

1,、細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí)，棄T25培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液,，用PBS清洗細(xì)胞一次,；

2、添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中,，倒置顯微鏡下觀察,，待細(xì)胞回縮變圓后加入5ml*培養(yǎng)液終止消化,，再輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中,，1000rpm離心 5min,；

3、 棄上清,，沉淀細(xì)胞加入1ml的雅吉生物無(wú)血清凍存液（貨號(hào)：C7001）,，混勻后加入凍存管中。

4,、 將凍存細(xì)胞直接放入-80℃冰箱即可,，如后期要將細(xì)胞轉(zhuǎn)入液氮罐中，則需在-80℃冰箱 中存放24小時(shí)以上再轉(zhuǎn)入液氮罐中,。

C,、細(xì)胞復(fù)蘇：

1、從液氮中取出細(xì)胞凍存管（注意佩戴防護(hù)面具）,，快速將其置入 37℃水浴中解凍,， 直至凍存管中無(wú)結(jié)晶，然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁,；

2,、將凍存管中的細(xì)胞移至含 5ml *培養(yǎng)基的15ml離心管中，1000rpm離心5min,；

3,、棄上清，沉淀用5ml*培養(yǎng)基重懸,，接種至T25培養(yǎng)瓶,，放于37℃,5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4,、第二天,，換用新鮮*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

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四,、注意事項(xiàng)：有些細(xì)胞比較特殊,，如貼壁不牢，在運(yùn)輸過(guò)程中發(fā)生容易細(xì)胞脫落,，這是正?，F(xiàn)象。請(qǐng)將培養(yǎng)瓶所有培養(yǎng)液收集至離心管,，1000rpm離心5min,，收集上清作過(guò)渡培養(yǎng)（后期對(duì)比培養(yǎng)），沉淀加入胰酶1-2ml,，輕輕吹打,，重懸,，消化1-2分鐘后，加5ml*培養(yǎng)基終止反應(yīng),。再離心,，棄上清，加1-2ml*培養(yǎng)基重懸,。然后按1:2比例進(jìn)行分瓶傳代（兩個(gè)T25）,，補(bǔ)充新的*培養(yǎng)基至5-8ml/瓶，最后放入37℃,5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。

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五,、售后條款：

1）細(xì)胞出現(xiàn)問(wèn)題，可重發(fā)的情況有哪些,？判定標(biāo)準(zhǔn)是什么,？

1. 細(xì)胞運(yùn)輸途中遭遇的各種問(wèn)題，細(xì)胞丟失,、瓶身破損,、培養(yǎng)液嚴(yán)重漏液等，重發(fā),；

2. 細(xì)胞污染問(wèn)題,，請(qǐng)?jiān)谑盏疆a(chǎn)品48小時(shí)內(nèi)，給我們提出真實(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,，核實(shí)后重發(fā),；

3. 常溫發(fā)貨的細(xì)胞靜置24小時(shí)后，干冰凍存發(fā)貨的細(xì)胞復(fù)蘇后24小時(shí)后,，絕大多數(shù)細(xì)胞未存活,，（需提供真實(shí)清晰的細(xì)胞狀態(tài)照片），重發(fā),；

4. 干冰凍存發(fā)貨的細(xì)胞復(fù)蘇后24小時(shí)后或常溫發(fā)貨的細(xì)胞靜置4小時(shí)候并且未開(kāi)封,，出現(xiàn)污染，重發(fā),；

5. 細(xì)胞活性問(wèn)題,，請(qǐng)?jiān)谑盏疆a(chǎn)品7天內(nèi)給我們提出真實(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用臺(tái)盼藍(lán)染色法鑒定細(xì)胞活力,，核實(shí)后予重發(fā),；

6. 細(xì)胞收到當(dāng)天以及第2,3天請(qǐng)拍照，3天未告知的,，視為產(chǎn)品合格,。4-7天內(nèi)出現(xiàn)問(wèn)題有提供收到細(xì)胞前3天照片和細(xì)胞出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)照片以及細(xì)胞相關(guān)操作的詳細(xì)步驟的,，并跟技術(shù)人員溝通的,，由技術(shù)人員判定為我方責(zé)任的,，重發(fā)。技術(shù)人員判定為雙方承擔(dān)責(zé)任的由雙方進(jìn)行協(xié)商處理或者按合同價(jià)的50%收費(fèi)重發(fā),。

2）細(xì)胞出現(xiàn)問(wèn)題,，不予以重發(fā)的情況有哪些？

1. 客戶造成細(xì)胞污染,，不重發(fā),；

2. 客戶不正確操作致細(xì)胞狀態(tài)不好，不重發(fā),；

3. 非本庫(kù)推薦細(xì)胞培養(yǎng)體系致的細(xì)胞狀態(tài)不好,，不重發(fā)；

4. 細(xì)胞狀態(tài)不好,，未提供細(xì)胞培養(yǎng)前3天照片的,，不重發(fā)；

5. 細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)經(jīng)其它處理的,，不重發(fā),；

6. 細(xì)胞收到2天內(nèi)，未告知,，不重發(fā),；

7. 視具體情況而定。 

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