HBMEC,；人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞是T25直接發(fā)貨的形式。收到細(xì)胞后,，拆開包裝T25瓶的自封袋,，不拆封口膜，表面噴75%酒精消毒后顯微鏡觀察細(xì)胞狀態(tài)（有條件可以拍下此時細(xì)胞照片）,。將細(xì)胞放入37度培養(yǎng)箱平衡兩小時以上,，再處理細(xì)胞。首先將T25中培養(yǎng)基取出裝好備用,，如細(xì)胞密度高于80%,，可以直接消化傳代，相反則加入5-6mL培養(yǎng)基放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)即可,。

1,、細(xì)胞名稱：HBMEC；人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞 

2,、生長特性：    □ 貼壁   （貼壁不牢容易脫落,，消化無需胰酶請謹(jǐn)慎操作。）

3,、細(xì)胞生長條件：

培養(yǎng)條件	90%DMEM（高糖）+10%FBS+1%P/S
溫度	37℃
空氣條件	5% CO2,100% AIR
傳代方法	1:2傳代,，2~3天換液
凍存條件	90%FBS+10%DMSO

4.HBMEC；人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞背景資料：我們推薦使用AAV-293細(xì)胞株繁殖腺病毒相關(guān)重組病毒。 AAV-293源自普遍使用的 HEK293細(xì)胞株,，但產(chǎn)生的病毒滴度更高,。 HEK293細(xì)胞是剪切過的腺病毒5型DNA轉(zhuǎn)染的人胚腎細(xì)胞。 跟HEK293細(xì)胞一樣,，AAV-293細(xì)胞反式表達(dá)腺病毒E1基因,，當(dāng)共轉(zhuǎn)染三個AAV助質(zhì)粒(一個含ITR的質(zhì)粒，pAAV-RC, 和E1缺失助質(zhì)粒)時,，可以產(chǎn)生有感染力的腺病毒-相關(guān)病毒顆粒,。

二．使用方法

1、您收到細(xì)胞后,，請按照以下方法進(jìn)行操作：

取出25cm²培養(yǎng)瓶,，75%酒精擦拭培養(yǎng)瓶，拆下封口膜,，放入37℃,，5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置3-4小時以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)，然后換用新鮮*培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)或進(jìn)行傳代,。

 

2,、細(xì)胞傳代：

1）細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時，棄25cm²培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液,，用PBS清洗細(xì)胞一次,；

2）用5-6ml*培養(yǎng)基輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中,，1000rpm離心5min,；

3）棄上清，沉淀細(xì)胞用12ml*培養(yǎng)基重懸,，然后按1:2比例進(jìn)行分瓶傳代,，zui后放入37℃，5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),；

4）待細(xì)胞*貼壁后,，觀察培養(yǎng)結(jié)果，之后進(jìn)行換液培養(yǎng)或傳代,。

3,、細(xì)胞凍存：

1）細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時，棄25cm²培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液,，用PBS清洗細(xì)胞一次,；

2）添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察,，待細(xì)胞回縮變圓后加入*培養(yǎng)液終止消化,，輕輕吹打細(xì)胞使之脫落,，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心5min,；

3）用適量的凍存液（FBS：DMSO=9 ：1）重懸細(xì)胞,，并放置于凍存管中；

4）先將細(xì)胞凍存管放置于-20℃ 1.5h,，然后將其移入-80℃過夜,，24h后轉(zhuǎn)入液氮中進(jìn)行長期保存。使用程序降溫盒可直接放入-80℃,。 

4,、細(xì)胞復(fù)蘇：
1）從液氮中取出細(xì)胞凍存管（注意：佩戴防爆管面具），快速將其置入37℃水浴中解凍,，直至凍存管中無結(jié)晶,，然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁；
2）將凍存管中的細(xì)胞移至含5ml*培養(yǎng)基的15ml離心管中,， 1000rpm離心5min,；

3）棄上清，沉淀用5ml*培養(yǎng)基重懸,，接種25cm²培養(yǎng)瓶,，于37℃，5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),；

4）第二天,，換用新鮮*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

T25瓶處理方法

收到后,，檢查外包裝是否完整，細(xì)胞培養(yǎng)瓶是否完好,。如有破損漏液等問題,，請即時。并進(jìn)行以下操作：

1. 75%酒精棉球擦拭T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶外部,。

2. 將細(xì)胞放入37度培養(yǎng)箱中預(yù)溫3-4小時后再做處理,，以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。

3. 預(yù)熱培養(yǎng)基（含10%胎牛血清,，1%雙抗）,。

4. 顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，并對細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照保存（40×,100×,200×各一張）,。

5. ①若細(xì)胞密度較小,，無菌操作，去掉培養(yǎng)基,。每瓶添加第四步中準(zhǔn)備的5-6ml培養(yǎng)基,。放到37度培養(yǎng)箱培養(yǎng),。待細(xì)胞密度達(dá)到80%以上，進(jìn)行傳代,。

②若細(xì)胞密度較大,，達(dá)到80%以上，將細(xì)胞傳代培養(yǎng),。

注：

培養(yǎng)瓶里的培養(yǎng)基血清濃度為5%,，建議更換成自己配好的新鮮培養(yǎng)基。由于運(yùn)輸過程中的問題,，細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的貼壁細(xì)胞有可能從瓶壁中脫落下來,，顯微鏡下觀察會出現(xiàn)細(xì)胞懸浮的情況，這時請在拍照后將懸浮的細(xì)胞即時離心,，加15%血清的*培養(yǎng)基到新的培養(yǎng)皿/瓶繼續(xù)培養(yǎng)3天,；同時原培養(yǎng)瓶中剩下的貼壁細(xì)胞更換為15%血清的*培養(yǎng)基。（這里是針對原來*培養(yǎng)基FBS濃度是10%的情況,，如果原來FBS濃度是20%,，可以增加到25%FBS濃度）   收到細(xì)胞后如細(xì)胞狀態(tài)不佳或培養(yǎng)中遇到問題，煩請當(dāng)天盡快并提供圖片,，以便售后處理,。7天內(nèi)反饋，本身問題免費(fèi)重發(fā)如人為原因?qū)е驴筛鶕?jù)實際情況酌情處理,；7天內(nèi)未接到任何反饋視為合格,，不予免費(fèi)售后