詳細介紹
生長特性:貼壁,懸浮,半懸浮半貼壁
培養(yǎng)條件:640+10%FBS+1%雙抗
溫度:37℃
空氣條件:5% CO2,,95% AIR
傳代方法:1:2傳代,,2~3天換液
凍存條件:90%FBS+10%DMSO
人前列腺正常細胞,RWPE-2 (BHS)操作說明
請仔細閱讀本操作說明及相應(yīng)的細胞說明書,。
收貨
<1>本公司的人前列腺正常細胞,RWPE-2 (BHS)發(fā)貨有四種形式:T25瓶、離心管,、血清及干冰。
T25是用T25細胞培養(yǎng)瓶直接發(fā)貨的形式,。收到細胞后,,拆開包裝T25瓶的自封袋,不拆封口膜,,表面噴75%酒精消毒后顯微鏡觀察細胞狀態(tài)(有條件可以拍下此時細胞照片),。將細胞放入37度培養(yǎng)箱平衡兩小時以上,再處理細胞,。首先將T25中培養(yǎng)基取出裝好備用,,如細胞密度高于80%,可以直接消化傳代,,相反則加入5-6mL培養(yǎng)基放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)即可,。
離心管是用15mL離心管發(fā)貨的方式,只用于懸浮細胞發(fā)貨,。收到細胞后消毒處理及平衡參考上述T25瓶,。平衡完成后,離心(1000rpm,,3min)收集細胞,,棄上清,用新的培養(yǎng)基重懸細胞并接種至培養(yǎng)瓶或皿中,,放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),。
血清是用牛血清直接發(fā)貨的形式,是細胞凍存管加入含有細胞的牛血清的形式,。收到細胞后,,拆開自封袋,凍存管表面噴75%酒精消毒后,在超凈臺中打開凍存管,,將細胞用1mL槍頭輕輕幾次以將細胞吹勻,,接種至含有預(yù)熱的培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶或皿中,顯微鏡下觀察細胞是否吹勻,,如果沒有吹勻,,繼續(xù)吹勻至3-5個細胞一團,放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),。
干冰是用本公司凍存液凍存細胞后,,直接用干冰將凍存的細胞冷凍發(fā)貨的形式。收到細胞后按照細胞復(fù)蘇的步驟操作即可,。
<2>相關(guān)問題
如不能在收到人前列腺正常細胞,RWPE-2 (BHS)后及時操作細胞,,T25及離心管發(fā)貨的細胞可以消毒后在37度過夜,血清發(fā)貨的細胞可以在室溫下靜置1-2天(注意不要放冰箱),,干冰發(fā)貨的可以在確認干冰未*升華時將細胞直接放回液氮或者-80度冰箱,,若干冰*升華,請即刻復(fù)蘇細胞,。
T25瓶及離心管在培養(yǎng)箱平衡是為了讓細胞盡快適應(yīng)培養(yǎng)箱環(huán)境,,同時使部分因運輸導(dǎo)致脫落的細胞貼壁,此步驟非常必要,。T25瓶如果在顯微鏡下可以看到部分不貼壁的細胞,,可以收集上清后離心(1200rpm,5min)后,,將沉淀用新的培養(yǎng)基重懸后接種至新的培養(yǎng)瓶或皿中,。
部分細胞在運輸過程中,由于不斷震蕩及環(huán)境不適,,可能導(dǎo)致細胞破碎死亡,,從而使培養(yǎng)基中漂浮很多細胞碎片及顆粒狀物質(zhì)。這種情況下,,平衡后,,貼壁細胞用PBS洗兩遍在加新的培養(yǎng)基培養(yǎng)或者傳代至新瓶中培養(yǎng)即可;懸浮細胞可以離心(1000rpm,,3min)收集細胞,,并用PBS重懸后再離心一次,再用新的培養(yǎng)基重懸并接種細胞,。
細胞培養(yǎng)及傳代
<1>細胞培養(yǎng)
細胞請于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),,大部分細胞是37℃,5% CO2,,濕度100%環(huán)境下培養(yǎng)的,。有極少部分細胞培養(yǎng)條件不*,請仔細閱讀相應(yīng)的細胞說明書,使用正確的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件,;
細胞于培養(yǎng)瓶或皿中培養(yǎng),,加入適量說明書上標注的細胞相應(yīng)*培養(yǎng)基(一般液面高度2-3mm即可)。
<2>細胞傳代(以下步驟適用于10cm皿)
細胞培養(yǎng)至密度達80%以上時即可傳代,,先將細胞培養(yǎng)基取出3mL用15mL離心管裝好,,其他培養(yǎng)基全部吸干舍棄;
培養(yǎng)皿加入2-3mL無菌PBS,,輕輕晃動皿,,使PBS浸洗到皿底所有部位,PBS吸干舍棄,;
加入1mL胰酶,,輕輕晃動皿,使胰酶浸沒到皿底所有部位,,將皿蓋好放入培養(yǎng)箱中消化,;
3min后,顯微鏡下觀察細胞,,若大部分細胞不再貼壁,,即可加入*步收集的培養(yǎng)基混勻;
若細胞還是貼壁,,放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至不貼壁為止;
將細胞懸液均勻分成幾份,,分別加入不同培養(yǎng)皿中,,補加新培養(yǎng)基后放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
<3>相關(guān)問題
部分細胞在傳代后時,,會有以下現(xiàn)象:細胞內(nèi)會有黑色小點,、細胞間隙有些顆粒物、培養(yǎng)基漂浮一些死細胞或者細胞長的極慢,。出現(xiàn)以上現(xiàn)象時,,可以咨詢本公司技術(shù)人員此現(xiàn)象是否正常及相關(guān)處理方式,不要頻繁換液,,大多數(shù)細胞1周換液2-3次即可,。
細胞碎片較多、背景較臟時,,貼壁細胞用PBS漂洗兩次,、懸浮細胞打散后低速離心(900rpm,3min)能有效改善,。
傳代比例建議1:2-1:3,,長得比較快的細胞可以1:3,比較慢的按1:2傳代。傳代后,,建議不要使用傳代前培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基,,會有大量細胞碎片甚至導(dǎo)致細胞死亡的風險。
細胞狀態(tài)不好或者生長極慢的時候,,可以通過增加血清濃度調(diào)整細胞狀態(tài)及生長速度,。
請不要隨意更換培養(yǎng)基,因?qū)嶒炐枰?,可以逐步馴化,。
懸浮傳代:混勻細胞,收集細胞懸液900-1000rpm離心3min,,棄上清,。再加5ml PBS重懸細胞,再離心后,,用*培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)皿,。第二次PBS重懸是為了去除碎片,如果平時碎片比較少,,傳代時可以省略PBS重懸的步驟,;如果碎片很多,建議PBS多洗一次,。
細胞凍存
<1>凍存操作
凍存液配方:建議使用92%FBS+8%DMSO,,客戶自身實驗室所使用的凍存液也可以適用,血清濃度不低于30%,,DMSO含量不高于12%即可,。
收集細胞按照以上細胞傳代步驟操作至第④步后,將細胞懸液收集入15mL離心管,,離心(1200rpm,,3min);
棄上清,,加入配制好的凍存液,,重懸細胞,懸液加入無菌凍存管中,;
將凍存管在4℃靜置10min,,后將之正置于室溫下的厚壁有蓋泡沫盒中,蓋緊盒蓋,,放入-80℃冰箱過夜,,第二天放入液氮即可長期保存。
<2>相關(guān)問題
10cm皿的細胞長滿一般可以凍存2-3管,,部分細胞長的比較慢,,凍存的細胞密度要稍微大點,,以防止復(fù)蘇后生長困難。
凍存液中含的DMSO請使用細胞級DMSO,,同時濃度不要太高,。部分細胞在10%DMSO條件下凍存會死亡,所以DMSO濃度5%-8%是比較推薦的濃度,。
細胞凍存及復(fù)蘇遵循慢凍快融的原則,,即凍存時溫度不能急劇下降,應(yīng)控制溫度緩慢下降,。復(fù)蘇時應(yīng)快速融化,,融化后盡快加入培養(yǎng)基中。
凍存時建議設(shè)置凍存檢測,,即取0.2-0.3mL的凍存液重懸的細胞于一個凍存管中,,與正常體積凍存的細胞共同凍存,至液氮后復(fù)蘇檢查凍存結(jié)果,。凍檢合格前,,留一部分細胞繼續(xù)培養(yǎng),以防萬一,。
人前列腺正常細胞,RWPE-2 (BHS)復(fù)蘇
<1>復(fù)蘇步驟
將凍存細胞從液氮中取出后迅速放入37℃溫水中搖晃融化,,時間1min左右;
于1000rpm離心1min,,棄凍存液,,加入1mL新的*培養(yǎng)基重懸細胞;
接種至新培養(yǎng)瓶或皿中,,補加足量*培養(yǎng)基,,放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
<2>相關(guān)問題
復(fù)蘇過程應(yīng)迅速操作,,時間不能太長。
復(fù)蘇過程中注意污染,,小心操作,。
細胞培養(yǎng)需要耐心與細心,希望您能獲得一個滿意結(jié)果,!
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