本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中大鼠2,5 寡腺苷酸合成酶（2,5-OAS）水平。

? 本試劑盒用于體外定量檢測(cè)血清,、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中人鞭毛蛋白(flagellin)Elisa試劑盒的含量
? 有效期：6個(gè)月
? 保存條件：2-8℃
? 本試劑盒僅供科研使用,，不得用于臨床診斷
檢測(cè)前準(zhǔn)備工作：
1. 請(qǐng)?zhí)崆?0 分鐘從冰箱中取出試劑盒,，平衡至室溫。
2. 從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶,，屬于正常現(xiàn)象,；放置室溫,，輕搖均勻，
待結(jié)晶*溶解后再配置洗滌液,?？蓪?0ml 濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水
稀釋配置成500ml 工作濃度的洗滌液，未用完的放回4℃
3. 20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20 稀釋,，即1 份20×洗滌緩沖液加19
4. 份蒸餾水,。
實(shí)驗(yàn)所需自備試驗(yàn)器材：
1. 酶標(biāo)儀（450nm）
2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL,、20-200uL,、200-1000uL
3. 37℃恒溫箱
4. 蒸餾水或去離子水
人鞭毛蛋白(flagellin)Elisa試劑盒組成：
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備注：
1.（96T/48T）打開(kāi)包裝后請(qǐng)及時(shí)檢查所有物品是否齊全。
2.標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為：10,、5,、2.5、1.25,、0.625,、0 ng/mL
樣本處理及要求：
1. 血清：室溫血液自然凝固10-20 分鐘,，離心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)
收集上清,，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀,，應(yīng)再次離心。
2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑,，混合10-20 分鐘后,，離心
20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清,，保存過(guò)程中如有沉淀形成,，應(yīng)該再
次離心。
3. 尿液：用無(wú)菌管收集,，離心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清，保存
過(guò)程中如有沉淀形成,，應(yīng)再次離心,。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行,。
4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí),，用無(wú)菌管收集。離心20 分鐘左右（2000-3000
轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液,，
細(xì)胞濃度達(dá)到100 萬(wàn)/ml 左右,。通過(guò)反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份,。離心
20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成,，應(yīng)再
次離心,。
5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量,。加入一定量的PBS,，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存
備用,。標(biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度,。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻
漿器將標(biāo)本勻漿充分,。離心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,。分裝
后一份待檢測(cè)，其余冷凍備用,。
6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取,，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn),。若不能馬上
進(jìn)行試驗(yàn),，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.
7. 不能檢測(cè)含NaN3 的樣品,，因NaN3 抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性,。
人鞭毛蛋白(flagellin)Elisa試劑盒注意事項(xiàng)：
1. 嚴(yán)格按照規(guī)定的時(shí)間和溫度進(jìn)行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達(dá)到
室溫20-25℃,。使用后立即冷藏保存試劑,。
2. 洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體,。溫育過(guò)程
中不要讓微孔干燥掉,。
3. 消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD 值,。
4. 底物顯色液應(yīng)呈無(wú)色或很淺的顏色,，已經(jīng)變藍(lán)的底物液不能使用。
5. 避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯(cuò)誤結(jié)果,。
6. 在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射,。
7. 平衡至室溫后再打開(kāi)密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。
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8. 任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強(qiáng)烈氣體,。任何漂白成分都會(huì)破
壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性,。
9. 不能使用過(guò)期產(chǎn)品,不同批號(hào)組分不得混用。
10. 如果可能傳播疾病,，所有的樣品都應(yīng)管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測(cè)裝置,。
操作步驟：
1.標(biāo)準(zhǔn)品的加樣：設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；,。
2.加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,，其余各步操作相同）、待測(cè)樣
品孔,。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,，然后再加待測(cè)樣品10μl（樣品
zui終稀釋度為5 倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動(dòng)混勻,。
3.加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑100μl，空白孔除外,。
4.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育60 分鐘,。
5.配液：將20 倍濃縮洗滌液用蒸餾水20 倍稀釋后備用。
6.洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體,，甩干，每孔加滿洗滌液,，靜置30 秒后棄去,，如此重
復(fù)5 次，拍干,。
7.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl,，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色
15 分鐘.
8.終止：每孔加終止液50μl,，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。
9.測(cè)定：以空白孔調(diào)零,，450nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD 值）,。測(cè)定應(yīng)在加終
止液后15 分鐘以內(nèi)進(jìn)行。
計(jì)算：
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo),，OD 值為縱坐標(biāo),，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD
值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD 值計(jì)算出標(biāo)
準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD 值代入方程式,，計(jì)算出樣品濃度,，再乘以稀釋
倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度,。
（此圖僅供參考）
人鞭毛蛋白(flagellin)Elisa試劑盒性能：
1. 檢測(cè)范圍：0.3125 ng/mL - 10 ng/mL
2. 批內(nèi)與批間應(yīng)分別小于9%和11%
3. 靈敏度：zui低檢測(cè)濃度小于0.1 ng/mL