化工儀器網(wǎng)
詳細介紹
實驗原理：
微生物還原型輔酶I(NADH)Elisa試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本水平。用純化的轉(zhuǎn)移酶水解酶（XTH）捕獲抗體包被微孔板,，制成固相抗體,，往包被的微孔中依次加入，再與HRP標記的檢測抗體結(jié)合,，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物,，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，通過標準曲線計算樣品中含量,。
?本試劑盒用于體外定量檢測血清,、血漿、組織勻漿及相關液體樣本中的活性,。
?有效期：6個月
?保存條件：2-8℃
?僅供科研使用,，不得用于臨床診斷
檢測前準備工作：
1.請?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫,。
2.從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶,，屬于正常現(xiàn)象,；放置室溫,，輕搖均勻，待結(jié)晶*溶解后再配置洗滌液,?？蓪?0ml濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水稀釋配置成500ml工作濃度的洗滌液，未用完的放回4℃
3.20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋,，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水,。
實驗所需自備試驗器材：
1.酶標儀（450nm）
2.高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL,、20-200uL,、200-1000uL
3.37℃恒溫箱
4.蒸餾水或去離子水
微生物還原型輔酶I(NADH)Elisa試劑盒組成：
備注：
1.（96T/48T）打開包裝后請及時檢查所有物品是否齊全。
2.標準品濃度依次為：200,、100、50,、25,、12.5、0 mU/mL
樣本處理及要求：
1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀,，應再次離心,。
2. 血漿：應根據(jù)標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成,，應該再次離心,。
3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清,，保存過程中如有沉淀形成,，應再次離心。胸腹水,、腦脊液參照實行,。
4. 細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時,，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液,，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融,，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清,。保存過程中如有沉淀形成,，應再次離心。
5. 組織標本：切割標本后,，稱取重量,。加入一定量的PBS，PH7.4,。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4）,，用手工或勻漿器將標本勻漿充分,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清,。分裝后一份待檢測,，其余冷凍備用。
6. 標本采集后盡早進行提取,，提取按相關文獻進行,，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗,，可將標本放于-20℃保存,，但應避免反復凍融.
7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性,。
微生物還原型輔酶I(NADH)Elisa試劑盒注意事項：
1.嚴格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準確結(jié)果,。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑,。
2.洗板不正確可以導致不準確的結(jié)果,。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體,。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。
3.消除板底殘留的液體和手指印,，否則影響OD值,。
4.底物顯色液應呈無色或很淺的顏色，已經(jīng)變藍的底物液不能使用,。
5.避免試劑和標本的交叉污染以免造成錯誤結(jié)果,。
6.在儲存和溫育時避免強光直接照射。
7.平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上,。
8.任何反應試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強烈氣體,。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應試劑的生物活性。
9.不能使用過期產(chǎn)品,不同批號組分不得混用,。
10.如果可能傳播疾病,，所有的樣品都應管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置,。
操作步驟：
1.標準品的加樣：設置標準品孔和樣本孔,，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；,。
2.加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑,，其余各步操作相同）、待測樣品孔,。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,，然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻。
3.加酶：每孔加入酶標試劑100μl,，空白孔除外。
4.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育60分鐘,。
5.配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用,。
6.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體,，甩干,，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去,，如此重復5次,，拍干。
7.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl,，再加入顯色劑B50μl,，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色15分鐘.
8.終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）,。
9.測定：以空白孔調(diào)零,，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行,。
計算：
以標準物的濃度為橫坐標,，OD值為縱坐標，
在坐標紙上繪出標準曲線,，根據(jù)樣品的OD
值由標準曲線查出相應的濃度,；再乘以稀釋
倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標
準曲線的直線回歸方程式,，將樣品的OD值
代入方程式,，計算出樣品濃度，再乘以稀釋 
（此圖僅供參考）
倍數(shù),，即為樣品的實際濃度,。
試劑盒性能：
1.檢測范圍：6.25 mU/mL - 200 mU/mL
2.批內(nèi)與批間應分別小于9%和11%靈敏度：zui低檢測濃度小于1.0 mU/mL
微生物還原型輔酶I(NADH)Elisa試劑盒性能：
1.檢測范圍：6.25 mU/mL - 200 mU/mL
2.批內(nèi)與批間應分別小于9%和11%
靈敏度：zui低檢測濃度小于1.0 mU/mL
化工儀器網(wǎng)