兔堿性磷酸酶（ALP）Elisa試劑盒化作用相結(jié)合起來(lái)的一種敏感性很高的試驗(yàn)技術(shù),。由于抗原,、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行,，每加入一種試劑孵育后，可通過(guò)洗滌除去多余的游離反應(yīng)物,，從而保證試驗(yàn)結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性

兔堿性磷酸酶(ALP)Elisa試劑盒是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ),，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合起來(lái)的一種敏感性很高的試驗(yàn)技術(shù),。由于抗原,、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行，每加入一種試劑孵育后,，可通過(guò)洗滌除去多余的游離反應(yīng)物,，從而保證試驗(yàn)結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。在實(shí)際應(yīng)用中,，通過(guò)不同的設(shè)計(jì),，具體的方法步驟可有多種。即:用于檢測(cè)抗體的間接法(圖a),、用于檢測(cè)抗原的雙抗體夾心法(圖b)以及用于檢測(cè)小分子抗原或半抗原的抗原競(jìng)爭(zhēng)法等等,。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法

需要但未提供的材料及耗材
  1、酶標(biāo)儀
2,、精密移液器及一次性吸頭
3,、蒸餾水
4、洗瓶或者自動(dòng)洗板機(jī)
5,、37℃水浴鍋或恒溫箱
6,、500ml量筒
7、無(wú)粉一次性乳膠手套
 
【適用儀器】
  半自動(dòng)的酶標(biāo)儀,，如Thermo MK3，或者國(guó)產(chǎn)酶標(biāo)儀,。
 
【樣本要求】
  樣本類型和采集
以下只是列出樣品采集的一般指南,。所有樣本采集過(guò)程中，不得使用疊氮鈉做為防腐劑,。
1,、血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過(guò)程中避免任何細(xì)胞刺激,，4000rpm條件下離心20min,，小心地分離出血清，保存在- 20℃以下,，避免反復(fù)凍融,。
2、血漿：肝素,，EDTA，或檸檬酸鈉作為抗凝劑,。在4000rpm條件下,，離心20分鐘取上清，血漿保存在-20℃以下,，避免反復(fù)凍融。
 
樣本保存和穩(wěn)定性
樣本在2-8℃條件下,，可以儲(chǔ)存72h,，或者在- 20℃儲(chǔ)存6個(gè)月。樣本收集后,，不是一次檢測(cè)完,，請(qǐng)按一次用量分裝凍存，避免反復(fù)凍融,，使用時(shí)在室溫下解凍,，確保樣品均勻充分解凍。
兔堿性磷酸酶(ALP)Elisa試劑盒操作程序
1,、所有試劑和組分都先恢復(fù)到室溫（平衡1小時(shí)）,，標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣品,，建議做復(fù)孔,。
2、按前面試劑準(zhǔn)備中描述的方法,，配制好試劑盒各種組分的工作液,。
3、從鋁箔袋中取出所需板條,，剩余的板條用自封袋密封放回冰箱,。
4、設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔,、樣本孔和空白孔,，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL，樣本孔加待測(cè)樣本50μL,，空白孔不加,。
5、除空白孔外,，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL。
6,、用封板膜蓋住反應(yīng)板,，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
7,、揭開(kāi)封板膜,，棄去液體,，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液,，靜置20s,，甩去洗滌液，吸水紙上拍干,。
8,、如此重復(fù)4次（共洗板5次）。若使用自動(dòng)洗板機(jī),，請(qǐng)按洗板機(jī)操作程序進(jìn)行洗板,，添加浸泡20s的程序，可以提高檢測(cè)的精度,。洗板結(jié)束,，加底物前，要在干凈不掉屑的紙上,，充分拍干反應(yīng)板,。
9、將底物A和B按1:1體積充分混合,，所有孔中加入底物混合液100μL,。用封板膜蓋住反應(yīng)板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育15min,。
10,、所有孔加入終止液50μL，在酶標(biāo)儀上讀取各孔吸光度（OD值）,。
 
【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】
檢測(cè)完成后,，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度做為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的吸光度（OD值）作為橫坐標(biāo),，利用計(jì)算機(jī)軟件,，采用四參數(shù)Logistic曲線擬合（4-pl），創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,，通過(guò)樣本的吸光度（OD值），利用方程計(jì)算樣品的濃度值,。
如果樣品被稀釋,，通過(guò)上述方法測(cè)的的濃度值，要乘以稀釋倍數(shù),，才是樣品的zui終濃度,。
【檢驗(yàn)方法的局限性】
1、僅供科研使用,，不得用于臨床診斷,。
2,、在試劑盒標(biāo)示的有效期內(nèi)使用，過(guò)期產(chǎn)品不得使用,。
3,、跟其他廠家的試劑盒或者組分不能混用。
4,、使用試劑盒配套的樣品稀釋液,。
5、如果樣本值高于zui高標(biāo)準(zhǔn)品濃度值,，請(qǐng)將樣本適當(dāng)稀釋后,，再重新測(cè)定。
6,、待測(cè)樣本中存在的人抗鼠等異嗜抗體會(huì)干擾檢測(cè)結(jié)果,，檢測(cè)前，請(qǐng)排除該因素,。
7,、通過(guò)其他方法得到的檢測(cè)結(jié)果,，與本試劑盒測(cè)定結(jié)果不具有直接的可比性,。
【產(chǎn)品性能指標(biāo)】
1、物理性能
試劑盒的各液體組分應(yīng)澄清透明,、無(wú)沉淀或者絮狀物,。微孔板鋁箔袋應(yīng)真空包裝，無(wú)破損漏氣,。
2,、劑量反應(yīng)曲線線性
校準(zhǔn)品劑量反應(yīng)曲線相關(guān)系數(shù)r值，大于等于0.9900,。
3,、精密度
批內(nèi)精密度：三組已知的高、中,、低濃度樣品,，進(jìn)行二十次在同一個(gè)板塊內(nèi)精度評(píng)估。批內(nèi)變異系數(shù)CV%小于10%,。
批間精密度：三組已知的高,、中,、低濃度樣品,，進(jìn)行二十次在不同板塊內(nèi)精度評(píng)估。批間變異系數(shù)CV%小于15%,。
4,、靈敏度
zui低檢出劑量小于1.0mIU/L。
5,、回收率
三組已知的高、中,、低濃度樣品,，進(jìn)行五次回收率評(píng)估,，回收率在85%-115%之間,。
6、特異性
本試劑盒識(shí)別天然和重組豬胰島素（INS）,，與結(jié)構(gòu)類似物無(wú)交叉,。
7、穩(wěn)定性

客戶須知:

1,、液體類標(biāo)本（細(xì)胞培養(yǎng)上清,、組織勻漿、血清,、血漿,、尿液、胸水,、腹水,、腦脊液等）。
2,、樣本保存：請(qǐng)盡早檢測(cè)，2-8℃保存一天,；需更長(zhǎng)時(shí)間須冷凍（-20℃或-70℃）保存,。如需周期收集樣本，請(qǐng)將樣本及時(shí)分裝標(biāo)號(hào)后,，置-20℃或-70℃保存,；
3、請(qǐng)?zhí)崆案嬖V我們：您樣本的種屬,、樣本數(shù)量,、待測(cè)指標(biāo)及其他特殊要求。

購(gòu)買兔堿性磷酸酶(ALP)Elisa試劑盒承諾： 

1.有質(zhì)量問(wèn)題免費(fèi)包換,，合同上注明了的.（質(zhì)量問(wèn)題包括運(yùn)輸不當(dāng)，客戶在使用過(guò)程中測(cè)不出結(jié)果,，等等?。?nbsp;
2.全程技術(shù)指導(dǎo),。（包括售前的標(biāo)本收集，使用過(guò)程中不明白的地方,，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的數(shù)據(jù)分析,，有任何疑問(wèn)，我們技術(shù)都會(huì)即時(shí)給你去電） 
3.提供免費(fèi)代測(cè)的服務(wù),。（你只需把標(biāo)本寄過(guò)來(lái),，我們?yōu)槟愎?jié)省時(shí)間，幫你出結(jié)果,，原始數(shù)據(jù),，分析數(shù)據(jù)均可提供，一般時(shí)間是5天左右） 
4.客戶有任何問(wèn)題,，我們都是在一個(gè)工作日之內(nèi)給出解決方案,。售后和技術(shù)這一塊都是竭誠(chéng)為客戶服務(wù)。

【儲(chǔ)存條件及有效期】
  1,、2-8℃保存,，切勿冷凍，有效期6個(gè)月,。
  2,、開(kāi)封使用后，包被微孔板放入帶有干燥劑的自封袋中,，密閉自封袋,，并將全部試劑放回2-8℃冰箱。
  3,、開(kāi)封后,，按照建議的條件保存，校準(zhǔn)品,、包被微孔板和HRP標(biāo)記抗體,，有效期為14天，其他成分在標(biāo)簽標(biāo)明的有效期內(nèi)是穩(wěn)定的,。

兔堿性磷酸酶(ALP)Elisa試劑盒常見(jiàn)問(wèn)題分析
Q1.標(biāo)曲不顯色或顯色很弱,，樣本顯色

溶解標(biāo)準(zhǔn)品以及倍比稀釋時(shí)，未渦旋震蕩或不夠充分,。
標(biāo)準(zhǔn)品溶解,、倍比稀釋時(shí)均需要渦旋震蕩以保證充分混勻。單純依靠移液器反復(fù)吹打,，效率較低,、效果也不一定*。

 Q2.標(biāo)曲和樣本均不顯色

在孵育階段靜置在桌面上，這樣非常不利于抗原抗體之間的充分接觸,，導(dǎo)致顯色偏弱,。
 推薦孵育階段，使用ELISA的微孔板振蕩器,，調(diào)至合適的頻率,，使抗原抗體充分接觸，保證結(jié)合效果,。如果排除上述原因,，有可能是漏加了某個(gè)組分，如檢測(cè)抗體,、酶等,。對(duì)于比較馬虎的新手，一定要做好標(biāo)記和記錄,，或者使用添加染料的ELISA試劑盒,。

 Q3.標(biāo)曲顯色，樣本不顯色

當(dāng)樣本中目的蛋白濃度極低或者樣本中干擾因素較強(qiáng),，就無(wú)法檢測(cè)到,。目前ELISA仍然是蛋白檢測(cè)靈敏度zui高的方法，與不同技術(shù)結(jié)合后,，衍生出了多種類型的ELISA,，提高了檢測(cè)靈敏度。
對(duì)于目的蛋白濃度特別低的樣本,，可以嘗試用高敏ELISA,，但這也并不意味著一定能檢測(cè)到樣本濃度，只能說(shuō)可以提高樣本的可測(cè)率,，并使結(jié)果更加可靠,。因?yàn)橥ǔＳ闷胀‥LISA檢測(cè)的樣本OD值都偏低，而高敏ELISA可提高樣本OD值,，使之盡量位于標(biāo)曲范圍內(nèi),，得到的數(shù)值也更加可信。

 Q4.標(biāo)曲和樣本都顯色,，但復(fù)孔的CV大

這個(gè)問(wèn)題就跟移液器和實(shí)驗(yàn)者的操作有關(guān)了,。移液器的使用維護(hù)不規(guī)范，就會(huì)造成移液的誤差較大,；實(shí)驗(yàn)者自身的操作習(xí)慣,、加樣的*性對(duì)復(fù)孔的CV也有很大影響。
掌握移液器的正確使用和維護(hù),。關(guān)于個(gè)人的操作可練習(xí)移液動(dòng)作,、加快速度，確保移液的精密度。

Q5.本底偏高,，樣本值測(cè)不到

標(biāo)曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(對(duì)于高敏ELISA可以適當(dāng)放寬要求),。尤其是樣本值特別低的時(shí)候，本底過(guò)高會(huì)掩蓋目的信號(hào),，導(dǎo)致無(wú)法測(cè)到樣本值。
 在加入TMB顯色后,，需實(shí)時(shí)觀察標(biāo)曲顯色況,。通常在S5孔有肉眼可見(jiàn)的微弱藍(lán)色，即可終止反應(yīng),。

 Q6.樣本經(jīng)不同梯度稀釋,，計(jì)算得到的樣本值差異較大

有時(shí)候我們不清楚樣本中目的蛋白的濃度如何，應(yīng)該如何稀釋,，那么我們就會(huì)做下預(yù)實(shí)驗(yàn),，確定稀釋倍數(shù)。然而有時(shí)候同一樣本做了幾個(gè)不同梯度稀釋后,，計(jì)算得到的樣本值之間差異較大,，應(yīng)該選擇哪一個(gè)稀釋倍數(shù)呢？
 這里涉及到了基質(zhì)效應(yīng),。通常血清樣本加樣量較高時(shí),，血清中的各種蛋白會(huì)抑制抗原抗體的接觸，基質(zhì)效應(yīng)較明顯,。而經(jīng)過(guò)稀釋后,，干擾因素也隨之稀釋，影響就會(huì)較小,。當(dāng)某兩個(gè)梯度稀釋后,，計(jì)算得到的樣本值接近時(shí)，我們就可以認(rèn)為在該稀釋梯度時(shí),，樣本中的干擾因素影響較小,，計(jì)算得到的值也是接近真實(shí)的。然而這樣的稀釋是針對(duì)目的蛋白濃度較高的樣本而言,。對(duì)于濃度很低的樣本,，經(jīng)過(guò)多倍稀釋后，就更加測(cè)不到了,，此時(shí)可按照廠家說(shuō)明書(shū)推薦的加樣方式操作,。

 Q7.不同試劑盒中的組分能否通用

除非是公用的試劑如洗液、檢測(cè)緩沖液,，其它組分不建議用其它試劑盒的組分,，甚至是同一指標(biāo)不同批次的試劑盒里的組分。這些組分(包括標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液,、檢測(cè)抗體,、酶等)都是經(jīng)過(guò)優(yōu)化的，如果貿(mào)然使用其它試劑盒的組分,，有可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響,。