棉花Bt-Cry1Ac蛋白Elisa試劑盒化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗(yàn)技術(shù),。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行,，每加入一種試劑孵育后,，可通過洗滌除去多余的游離反應(yīng)物，從而保證試驗(yàn)結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性

棉花Bt-Cry1Ac蛋白Elisa試劑盒是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ),，將抗原,、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗(yàn)技術(shù),。由于抗原,、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行，每加入一種試劑孵育后,，可通過洗滌除去多余的游離反應(yīng)物,，從而保證試驗(yàn)結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。在實(shí)際應(yīng)用中,，通過不同的設(shè)計,，具體的方法步驟可有多種。即:用于檢測抗體的間接法(圖a),、用于檢測抗原的雙抗體夾心法(圖b)以及用于檢測小分子抗原或半抗原的抗原競爭法等等,。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法

需要但未提供的材料及耗材
  1、酶標(biāo)儀
2,、精密移液器及一次性吸頭
3,、蒸餾水
4、洗瓶或者自動洗板機(jī)
5,、37℃水浴鍋或恒溫箱
6,、500ml量筒
7,、無粉一次性乳膠手套
 
【適用儀器】
  半自動的酶標(biāo)儀，如Thermo MK3,，或者國產(chǎn)酶標(biāo)儀,。
 
【樣本要求】
  樣本類型和采集
以下只是列出樣品采集的一般指南。所有樣本采集過程中,，不得使用疊氮鈉做為防腐劑,。
1、血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激,，4000rpm條件下離心20min，小心地分離出血清,，保存在- 20℃以下,，避免反復(fù)凍融。
2,、血漿：肝素,，EDTA，或檸檬酸鈉作為抗凝劑,。在4000rpm條件下,，離心20分鐘取上清，血漿保存在-20℃以下,，避免反復(fù)凍融,。
 
樣本保存和穩(wěn)定性
樣本在2-8℃條件下，可以儲存72h,，或者在- 20℃儲存6個月,。樣本收集后，不是一次檢測完,，請按一次用量分裝凍存,，避免反復(fù)凍融，使用時在室溫下解凍,，確保樣品均勻充分解凍,。
棉花Bt-Cry1Ac蛋白Elisa試劑盒操作程序
1、所有試劑和組分都先恢復(fù)到室溫（平衡1小時）,，標(biāo)準(zhǔn)品,、質(zhì)控品和樣品，建議做復(fù)孔,。
2,、按前面試劑準(zhǔn)備中描述的方法，配制好試劑盒各種組分的工作液,。
3,、從鋁箔袋中取出所需板條,，剩余的板條用自封袋密封放回冰箱。
4,、設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔,、樣本孔和空白孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL,，樣本孔加待測樣本50μL,，空白孔不加。
5,、除空白孔外,，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體100μL,。
6,、用封板膜蓋住反應(yīng)板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min,。
7,、揭開封板膜，棄去液體,，吸水紙上拍干,，每孔加滿洗滌液，靜置20s,，甩去洗滌液,，吸水紙上拍干。
8,、如此重復(fù)4次（共洗板5次）,。若使用自動洗板機(jī)，請按洗板機(jī)操作程序進(jìn)行洗板,，添加浸泡20s的程序,，可以提高檢測的精度。洗板結(jié)束,，加底物前，要在干凈不掉屑的紙上,，充分拍干反應(yīng)板,。
9、將底物A和B按1:1體積充分混合,，所有孔中加入底物混合液100μL,。用封板膜蓋住反應(yīng)板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育15min,。
10,、所有孔加入終止液50μL,，在酶標(biāo)儀上讀取各孔吸光度（OD值）。
 
【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】
檢測完成后,，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度做為縱坐標(biāo),，對應(yīng)的吸光度（OD值）作為橫坐標(biāo)，利用計算機(jī)軟件,，采用四參數(shù)Logistic曲線擬合（4-pl）,，創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，通過樣本的吸光度（OD值）,，利用方程計算樣品的濃度值,。
如果樣品被稀釋，通過上述方法測的的濃度值,，要乘以稀釋倍數(shù),，才是樣品的zui終濃度。
【檢驗(yàn)方法的局限性】
1,、僅供科研使用,，不得用于臨床診斷。
2,、在試劑盒標(biāo)示的有效期內(nèi)使用,，過期產(chǎn)品不得使用。
3,、跟其他廠家的試劑盒或者組分不能混用,。
4、使用試劑盒配套的樣品稀釋液,。
5,、如果樣本值高于zui高標(biāo)準(zhǔn)品濃度值，請將樣本適當(dāng)稀釋后,，再重新測定,。
6、待測樣本中存在的人抗鼠等異嗜抗體會干擾檢測結(jié)果,，檢測前,，請排除該因素。
7,、通過其他方法得到的檢測結(jié)果,，與本試劑盒測定結(jié)果不具有直接的可比性。
【產(chǎn)品性能指標(biāo)】
1,、物理性能
試劑盒的各液體組分應(yīng)澄清透明,、無沉淀或者絮狀物。微孔板鋁箔袋應(yīng)真空包裝，無破損漏氣,。
2,、劑量反應(yīng)曲線線性
校準(zhǔn)品劑量反應(yīng)曲線相關(guān)系數(shù)r值，大于等于0.9900,。
3,、精密度
批內(nèi)精密度：三組已知的高、中,、低濃度樣品,，進(jìn)行二十次在同一個板塊內(nèi)精度評估。批內(nèi)變異系數(shù)CV%小于10%,。
批間精密度：三組已知的高,、中、低濃度樣品,，進(jìn)行二十次在不同板塊內(nèi)精度評估,。批間變異系數(shù)CV%小于15%。
4,、靈敏度
zui低檢出劑量小于1.0mIU/L,。
5、回收率
三組已知的高,、中,、低濃度樣品，進(jìn)行五次回收率評估,，回收率在85%-115%之間,。
6、特異性
本試劑盒識別天然和重組豬胰島素（INS）,，與結(jié)構(gòu)類似物無交叉,。
7、穩(wěn)定性

客戶須知:

1,、液體類標(biāo)本（細(xì)胞培養(yǎng)上清,、組織勻漿、血清,、血漿,、尿液、胸水,、腹水,、腦脊液等）。
2,、樣本保存：請盡早檢測，2-8℃保存一天；需更長時間須冷凍（-20℃或-70℃）保存,。如需周期收集樣本,，請將樣本及時分裝標(biāo)號后，置-20℃或-70℃保存,；
3,、請?zhí)崆案嬖V我們：您樣本的種屬、樣本數(shù)量,、待測指標(biāo)及其他特殊要求,。

購買承諾： 

1.有質(zhì)量問題免費(fèi)包換，合同上注明了的.（質(zhì)量問題包括運(yùn)輸不當(dāng),，客戶在使用過程中測不出結(jié)果,，等等！） 
2.全程技術(shù)指導(dǎo),。（包括售前的標(biāo)本收集,，使用過程中不明白的地方，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的數(shù)據(jù)分析,，有任何疑問,，我們技術(shù)都會即時給你去電） 
3.提供免費(fèi)代測的服務(wù)。（你只需把標(biāo)本寄過來,，我們?yōu)槟愎?jié)省時間,，幫你出結(jié)果，原始數(shù)據(jù),，分析數(shù)據(jù)均可提供,，一般時間是5天左右） 
4.客戶有任何問題，我們都是在一個工作日之內(nèi)給出解決方案,。售后和技術(shù)這一塊都是竭誠為客戶服務(wù),。

【儲存條件及有效期】
  1、2-8℃保存,，切勿冷凍,，有效期6個月。
  2,、開封使用后,，包被微孔板放入帶有干燥劑的自封袋中，密閉自封袋,，并將全部試劑放回2-8℃冰箱,。
  3、開封后,，按照建議的條件保存,，校準(zhǔn)品,、包被微孔板和HRP標(biāo)記抗體，有效期為14天,，其他成分在標(biāo)簽標(biāo)明的有效期內(nèi)是穩(wěn)定的,。

常見問題分析
Q1.標(biāo)曲不顯色或顯色很弱，樣本顯色

溶解標(biāo)準(zhǔn)品以及倍比稀釋時,，未渦旋震蕩或不夠充分,。
標(biāo)準(zhǔn)品溶解、倍比稀釋時均需要渦旋震蕩以保證充分混勻,。單純依靠移液器反復(fù)吹打,，效率較低、效果也不一定*,。

 Q2.標(biāo)曲和樣本均不顯色

在孵育階段靜置在桌面上,，這樣非常不利于抗原抗體之間的充分接觸，導(dǎo)致顯色偏弱,。
 推薦孵育階段,，使用ELISA的微孔板振蕩器，調(diào)至合適的頻率,，使抗原抗體充分接觸,，保證結(jié)合效果。如果排除上述原因,，有可能是漏加了某個組分,，如檢測抗體、酶等,。對于比較馬虎的新手,，一定要做好標(biāo)記和記錄，或者使用添加染料的ELISA試劑盒,。

 Q3.標(biāo)曲顯色,，樣本不顯色

當(dāng)樣本中目的蛋白濃度極低或者樣本中干擾因素較強(qiáng)，就無法檢測到,。目前ELISA仍然是蛋白檢測靈敏度zui高的方法,，與不同技術(shù)結(jié)合后，衍生出了多種類型的ELISA,，提高了檢測靈敏度,。
對于目的蛋白濃度特別低的樣本，可以嘗試用高敏ELISA,，但這也并不意味著一定能檢測到樣本濃度,，只能說可以提高樣本的可測率，并使結(jié)果更加可靠,。因?yàn)橥ǔＳ闷胀‥LISA檢測的樣本OD值都偏低,，而高敏ELISA可提高樣本OD值,，使之盡量位于標(biāo)曲范圍內(nèi)，得到的數(shù)值也更加可信,。

 Q4.標(biāo)曲和樣本都顯色,，但復(fù)孔的CV大

這個問題就跟移液器和實(shí)驗(yàn)者的操作有關(guān)了,。移液器的使用維護(hù)不規(guī)范,，就會造成移液的誤差較大；實(shí)驗(yàn)者自身的操作習(xí)慣,、加樣的*性對復(fù)孔的CV也有很大影響,。
掌握移液器的正確使用和維護(hù)。關(guān)于個人的操作可練習(xí)移液動作,、加快速度,，確保移液的精密度。

Q5.本底偏高,，樣本值測不到

標(biāo)曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(對于高敏ELISA可以適當(dāng)放寬要求),。尤其是樣本值特別低的時候，本底過高會掩蓋目的信號,，導(dǎo)致無法測到樣本值,。
 在加入TMB顯色后，需實(shí)時觀察標(biāo)曲顯色況,。通常在S5孔有肉眼可見的微弱藍(lán)色,，即可終止反應(yīng)。

 Q6.樣本經(jīng)不同梯度稀釋,，計算得到的樣本值差異較大

有時候我們不清楚樣本中目的蛋白的濃度如何,，應(yīng)該如何稀釋，那么我們就會做下預(yù)實(shí)驗(yàn),，確定稀釋倍數(shù),。然而有時候同一樣本做了幾個不同梯度稀釋后，計算得到的樣本值之間差異較大,，應(yīng)該選擇哪一個稀釋倍數(shù)呢,？
 這里涉及到了基質(zhì)效應(yīng)。通常血清樣本加樣量較高時,，血清中的各種蛋白會抑制抗原抗體的接觸,，基質(zhì)效應(yīng)較明顯。而經(jīng)過稀釋后,，干擾因素也隨之稀釋,，影響就會較小。當(dāng)某兩個梯度稀釋后,，計算得到的樣本值接近時,，我們就可以認(rèn)為在該稀釋梯度時,，樣本中的干擾因素影響較小，計算得到的值也是接近真實(shí)的,。然而這樣的稀釋是針對目的蛋白濃度較高的樣本而言,。對于濃度很低的樣本，經(jīng)過多倍稀釋后,，就更加測不到了,，此時可按照廠家說明書推薦的加樣方式操作。

 Q7.不同試劑盒中的組分能否通用

除非是公用的試劑如洗液,、檢測緩沖液,，其它組分不建議用其它試劑盒的組分，甚至是同一指標(biāo)不同批次的試劑盒里的組分,。這些組分(包括標(biāo)準(zhǔn)品,、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液、檢測抗體,、酶等)都是經(jīng)過優(yōu)化的,，如果貿(mào)然使用其它試劑盒的組分，有可能對結(jié)果產(chǎn)生影響,。