NCI-H596混合腺棘癌細(xì)胞

 無蛋白培養(yǎng)基與限定化學(xué)成分培養(yǎng)基

一,、無蛋白培養(yǎng)基(protein free midium,PFM):即不含有動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基。無血清培養(yǎng)基仍含有較多的動(dòng)物蛋白,，如胰島素,，轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛血清白蛋白等。從生物技術(shù)發(fā)展的趨勢來看,，不含動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基又廣泛的應(yīng)用前景,，許多利用基因工程技術(shù)重組的蛋白質(zhì)最終要應(yīng)用于人體，如果再生長過程中使用了含有動(dòng)物蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基,，純化過程就比較復(fù)雜,，最終要達(dá)到一定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也有一定的難度。無蛋白培養(yǎng)基就是為了適應(yīng)這發(fā)展趨勢而出現(xiàn)的,，許多無蛋白培養(yǎng)基添加了植物水解物以替代動(dòng)物激素,、生長因子的作用。市場上已有適合多種細(xì)胞生長的無蛋白培養(yǎng)基,。

二,、限定化學(xué)成分培養(yǎng)基(chemical defined medium,CDM):是指培養(yǎng)基中的素有成分都是明確的，它同樣不含有動(dòng)物蛋白,，同樣也不是添加了植物水解物,，而是使用了一些已知結(jié)構(gòu)與功能的小分子化合物，如短肽,、植物激素等,。這種培養(yǎng)基更有利于分析細(xì)胞的分泌產(chǎn)物。目前已經(jīng)有適合于293細(xì)胞,、CHO細(xì)胞,、雜交瘤細(xì)胞生長的CDM問世，

其他細(xì)胞培養(yǎng)用液

在細(xì)胞培養(yǎng)過程中,，除了培養(yǎng)基外,，還經(jīng)常用到一些平衡鹽溶液、消化液,、pH調(diào)整液等,。

一、平衡鹽溶液(balanced salt solution,BSS):主要是由無機(jī)鹽,、葡萄糖組成,，它的作用是維持細(xì)胞滲透壓平衡，保持pH穩(wěn)定及提供簡單的營養(yǎng),。主要用于取材時(shí)組織塊的漂洗、細(xì)胞的漂洗,、配制其他試劑等,。最簡單的BSS是Ringer。D-Hank's與Hank's的一個(gè)主要區(qū)別是前者不含有Ca2+,、Mg2+,，因此D-Hank's常用于配制胰酶溶液。Earle平衡液含有較高的NaHCO3(2.2g/L),適合于5%CO₂ 的培養(yǎng)條件，Hank's平衡液僅含有0.35g/L NaHCO₃,，不能用于5%CO₂的環(huán)境,，若放入CO₂培養(yǎng)相，溶液將迅速變酸,，使用時(shí)應(yīng)注意,。

配制溶液應(yīng)使用雙蒸水或去離子水。如果配方中含有Ca²⁺,、Mg²⁺,，應(yīng)當(dāng)首先溶解這些成分。配好的平衡鹽溶液可以過濾除菌或高溫滅菌,。

二,、消化液:取材進(jìn)行原代培養(yǎng)時(shí)常常需要將組織塊消化解離形成細(xì)胞懸液，傳代培養(yǎng)時(shí)也需要將貼壁細(xì)胞從瓶壁上消化下來,，常用的消化液有胰酶(Trypsin)溶液和EDTA溶液,，有時(shí)也用膠原酶(collagenase)溶液。

1,、胰酶溶液:胰酶活性可用消化酪蛋白的能力表示,，常見有1:125和1:250，即一份胰酶可消化125或250份酪蛋白,。組織培養(yǎng)用胰酶溶液一般配制成0.1-0.25%濃度,，配制時(shí)要用不含Ca²⁺ 、Mg²⁺及血清的平衡鹽溶液(如前面的D-Hank's),，因?yàn)檫@些物質(zhì)會(huì)對胰酶產(chǎn)生抑制作用,。胰酶作用及溶解的pH是8-9，配制胰酶溶液應(yīng)將液體調(diào)至pH8左右,，充分溶解,，過濾除菌。過濾后可以再調(diào)只pH7.5,，也可不調(diào),。

使用細(xì)胞清洗液配制胰酶消化液:含0.5%胰酶的細(xì)胞清洗液(100ml細(xì)胞清洗液加0.5g胰酶)，過濾除菌,，分裝于4度保存,。

2、EDTA溶液:EDTA溶液也常用來解離細(xì)胞,，它的作用機(jī)制是破壞細(xì)胞間的連接,。對于一些貼壁特別牢固的細(xì)胞，還可以用EDTA和胰酶的混合液進(jìn)行消化,。EDTA溶液的使用濃度為0.02%,，配制時(shí)應(yīng)加堿助溶,，配制后可過濾除菌，也可高溫消毒滅菌,。

3,、膠原酶溶液:膠原酶在上皮類細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)經(jīng)常使用，膠原酶作用的對象是膠原組織,，因此不容易對細(xì)胞產(chǎn)生損傷,。膠原酶的使用濃度為0.1-0.3mg/L或200000U/L,作用的pH為6.5。膠原酶不受Ca²⁺ ,、Mg²⁺及血清的抑制,，配制時(shí)可用PBS。

三,、pH調(diào)整液:常用的有HEPES液和NaHCO₃溶液,。

1、NaHCO₃溶液:NaHCO₃是培養(yǎng)基中必須添加的成分,，一般情況下按說明書的要求準(zhǔn)確添加,，以保證培養(yǎng)基在5%CO₂的環(huán)境下pH達(dá)到設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)。如果是封閉式培養(yǎng),，即不與5%CO₂的環(huán)境發(fā)生交換達(dá)到平衡,，所使用的培養(yǎng)基就不能按照說明書所要求加入NaHCO₃。此時(shí)常用5.6%或7.4%的NaHCO₃溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基,，使之達(dá)到所要求的pH環(huán)境,。

2、HEPES溶液:是一種弱酸,，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸,，對細(xì)胞無毒性，主要作用是防止培養(yǎng)基pH迅速變動(dòng),。在開放式培養(yǎng)條件下,，觀察細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)基脫離了5%CO₂的環(huán)境，CO₂ 氣體迅速逸出,，pH迅速升高,，若加了HEPES，此時(shí)可以維持pH7.0左右,。一般在進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時(shí)要添加HEPES,。

四、抗生素:常用的是青鏈霉素,，俗稱“雙抗溶液”,。青霉素主要是對革蘭陽性菌有效，鏈霉素主要對革蘭陰性菌有效,。加入這兩種抗生素可預(yù)防絕大多數(shù)細(xì)菌污染,。通常使用青霉素終濃度0.007-0.008g/100ml,鏈霉素終濃度0.01g/100ml。一般配制成100倍濃縮液,，可用PBS或培養(yǎng)基配制,。

五、谷氨酰胺補(bǔ)充液:谷氨酰胺在細(xì)胞代謝過程中起重要作用,，合成培養(yǎng)基中都要添加,，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定容易降解，4℃下放置7天即可分解約50%,，所以都是在使用前添加,。配制好的培養(yǎng)液(含谷氨酰胺)在4℃放置2周以上時(shí)，要重新加入原來量的谷氨酰胺,，故需單獨(dú)配制谷氨酰胺,，以便臨時(shí)加入培養(yǎng)液內(nèi)。谷氨酰胺使用終濃度為0.002mol/L,。一般配制為100倍濃縮液,，即濃度為200mmol/L(29.22g/L)，配制時(shí)應(yīng)加溫30℃,，*溶解后過濾除菌,，分裝至小瓶，儲(chǔ)存于-20℃,。使用時(shí),，在每100ml培養(yǎng)液中加入0.5~2ml谷氨酰胺濃縮液，終濃度為1~4mmol/L,。

六,、二肽谷氨酰胺(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)

在細(xì)胞培養(yǎng)液中L-谷氨酰胺是大部分細(xì)胞培養(yǎng)基的基本成分;而L-谷氨酰胺是一種并不穩(wěn)定的氨基酸，在中性的水溶液中會(huì)自發(fā)降解;需要頻繁地補(bǔ)加L-谷氨酰胺,。因而在培養(yǎng)操作過程中經(jīng)常:

(1)頻繁打開蓋子,，增加了破壞無菌狀態(tài)的可能性;

(2)過多的追加L-谷氨酰胺，增加了培養(yǎng)基中氨的毒性水平,。

二肽谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中穩(wěn)定而不降解,可高壓滅菌,釋放毒性氨最少!

二肽谷氨酰胺在細(xì)胞內(nèi)被氨肽酶(E.C.3.4.11.2)所水解,，產(chǎn)生L-谷氨酰胺和L-丙氨酸;因此在大部分細(xì)胞系統(tǒng)中二肽谷氨酰胺就可以象L-谷氨酰胺同樣有效地被利用。二肽谷氨酰胺是替代物,，它無需適應(yīng);既可用于貼壁細(xì)胞培養(yǎng),，也適合于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)。

NCI-H596混合腺棘癌細(xì)胞

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CCK-81細(xì)胞，腺癌細(xì)胞
Cell.line.primary.name細(xì)胞,，導(dǎo)管癌細(xì)胞
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CH-157MN細(xì)胞,，