M059K星形細胞瘤分級IV細胞

規(guī)格：25cm2培養(yǎng)瓶一瓶
特點：細胞代數(shù)為2-3代 
包裝：內層無菌自封袋；防壓泡沫盒；外層防壓保溫氣泡袋,；說明書 
細胞來源：ATCC、DSMZ,、ECACC以及少數(shù)國內外大學建系,。 
貨期：1-2周 
運輸方式：快遞運輸 

售后：收到人結腸腺癌細胞系；LS123后7天,，如發(fā)現(xiàn)細胞有質量問題（如污染,，死亡，快遞運輸?shù)仍颍r,，應出具書面質量問題報告并及時傳真或E-mail致銷售人員,，我們將盡快為您解決。 

二,、無菌操作基本技術 
1. 實驗進行前,，無菌室及無菌操作臺(laminar flow) 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面,，并開啟無菌操作臺風扇運轉10 分鐘后,，才開始實驗操作。每次操作只處理一株細胞株,，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基,，以避免失誤混淆或細胞間污染。實驗完畢后,，將實驗物品帶出工作臺,，以70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面。操作間隔應讓無菌操作臺運轉10 分鐘以上后,，再進行下一個細胞株之操作,。
2. 無菌操作工作區(qū)域應保持清潔及寬敞，必要物品,，例如試管架,、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置，其它實驗用品用完即應移出,，以利于氣流之流通,。實驗用品以70 % ethanol 擦拭后才帶入無菌操作臺內。實驗操作應在抬面之中央無菌區(qū)域,，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作,。
3. 小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染,。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口,，亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開后,，以手夾住瓶蓋并握住瓶身,，傾斜約45° 角取用,，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。
4. 工作人員應注意自身之安全,，須穿戴實驗衣及手套后才進行實驗,。對于來自人類或是病毒感染之細胞株應特別小心操作，并選擇適當?shù)燃壷疅o菌操作臺(至少Class II),。操作過程中,，應避免引起aerosol 之產生，小心毒性藥品,，例如DMSO 及TPA 等,，并避免尖銳針頭之傷害等。
5. 定期檢測下列項目：
5.1. CO2 鋼瓶之CO2 壓力 
5.2. CO2 培養(yǎng)箱之CO2 濃度,、溫度,、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水，每周更換),。
5.3. 無菌操作臺內之airflow 壓力,，定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜，預濾網(300小時/預濾網,，3000 小時/HEPA),。
6. 水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750)，定期更換水槽的水

1,、請問工作濃度的胰酶是不是應保存在－20度,？如果放在4度冰箱可以保存多久呢？是不是幾個小時就會失去活性,？
平時放在-20度,，分裝在50毫升螺口管，用時拿一管放4度用,。

2. 粉末培養(yǎng)基配制好后(加了血清),，一般在4度盡量不要超過1個月，如在-20度存放時間可長一些,，但*好也不要超過3-4個月,，可能對于永生化細胞株來說要求不是太高，但我在過去的4年里一直是做原代細胞培養(yǎng)的,，細胞嬌弱,，經驗表明放置時間不宜過長。
認真按照操作規(guī)程進行實驗,，一般不大會導致污染,，很多情況下是由于所用的試劑或培養(yǎng)基有污染而使實驗失敗，
 
3. 關于實驗用品的清洗與消毒，我的經驗是：用過的玻璃器皿先在清水中浸泡30min以上,，然后加少許清洗劑,，以超聲波洗滌30min左右，(如無超聲波洗滌器可用軟毛刷輕輕刷洗干凈),，撈出晾干,，再在鉻酸洗液中浸泡6-18h(或過夜)后，自來水清洗10-15遍,，雙蒸水清洗3-4遍，晾干,，高壓消毒后即可使用,。
許多塑料制品也可以高壓消毒，例如培養(yǎng)瓶蓋,，膠塞,，吸頭等。不能用于高壓的一般均已制成一次性作用的商品了,，當然如果money有限,，如進口的培養(yǎng)板、皿等,，也可以重復使用1-2次,，我當時使用方法是將其*清潔后，使用前在紫外燈下敞開照射1-1.5h即可,，我做過多次,，沒有出現(xiàn)問題。塑料培養(yǎng)瓶由于清洗消毒不便,，*好不要重復使用,，如一定要重復用，可用環(huán)氧乙烷等消毒,，(消毒后一定要放置半年以上方可使用)

在光鏡下,，上皮細胞通常呈“鋪路石”樣排布，細胞之間有拉絲現(xiàn)象（即距離較遠的細胞可以通過細長的觸手相連）,，細胞有成片生長的特性,。而間質細胞通常呈梭形，沒有有成片生長的特性,，細胞之間的聯(lián)系不緊密,。但是細胞的形態(tài)特征會因為生長條件的改變而改變，如HeLa細胞是上皮細胞,，但是在酸性培養(yǎng)條件下會變?yōu)樗笮?。上皮細胞之間都有特征性的緊密連接（橋粒）結構，因此可以通過觀察培養(yǎng)細胞的超微結構來判斷細胞的類型，如果有緊密連接,，就必然是上皮細胞,。這是一錘定音的證據(jù)。注意不要把細胞消化下來做電鏡,，要用細胞刮刮下來后做電鏡,。此外每一種上皮細胞都有其特征的細胞角蛋白的表達（cytokertin, CK）,可以查一下子宮內膜腺上皮細胞表達的CK分子，然后進行免疫細胞化學的鑒定,。
在偏堿的情況下培養(yǎng),，耐受能力會逐漸下降，可能是產生脫壁現(xiàn)象的原因,，后來我重新測了一下培養(yǎng)基,，為7.5左右，我用滅菌的HCL調了一下,，培養(yǎng)基顏色變成淡紅透亮,，再次培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)細胞貼壁比較好了,，搏動效果也不錯,，因此，我以后每次培養(yǎng)前都要重新調好PH值,，我覺得很多因素是能影響PH值的
血清質量不好,，影響了細胞生長。所以,，我認為以后養(yǎng)細胞,，用的血清濃度*好是每批次血清都摸一下，不一定要以參考文獻為準,，畢竟國產的血清質量差異比較大啊,。
人結腸腺癌細胞系；LS123細胞無菌操作是關鍵,，對于配制培養(yǎng)液時,，有些人為了讓培養(yǎng)粉充分溶解，攪拌4小時或更長時間,。其實這*沒有必要,，一般培養(yǎng)基的固體組分還是易溶于水的，攪拌的時間長了會增加污染機會,，雖然后來濾過除菌了,，但細菌的代謝產物比如脂多糖誰能夠把它濾掉？細菌的代謝是很快的,，甚至在常溫下20min就可以繁殖一代,，太可怕了,。我的經驗就是攪拌30min-60min就把它過濾。
另外關于培養(yǎng)基的pH問題,，一般按照說明書操作,，加入所說的NaHCO3量，與預計的pH不會有什么距離,，也就是說基本上不用調pH,，如果相差大，要考慮三蒸水的質量是否有所下降,，當然這時調pH也是不得已而為之,。我配培養(yǎng)基時基本上不調pH，只是用試紙檢測一下pH,，觀察一下培養(yǎng)基的顏色,。

（1）東西一定要用自己的。既不要借別人的,，也不要借給別人?？赡艽蠹矣X得比較自私,。實際上還是很有好處的。并不是每個人的操作都規(guī)范,，因此相互之間串著用,，很容易造成交叉污染。
（2）我習慣口對口倒液體,，在倒前倒后都要在酒精燈上過一下,。自己認為比起用吸管吸更能很好的防止污染。步驟越簡單,，越能防止污染,。而且還能節(jié)省很多吸管。
（3）一次將所有的所需要試劑,、工具放入工作臺,。不要做到半路，又出工作間拿東西,，這樣增加了污染的機會,。
（4）整個操作要快、動作要輕,、而且不要干其他的事情,。比如手機響了，*好不要接,。我一般操作的時候將手機關了,，手機聲音響起,，好煩躁。
（5）我一般開紫外線照射臺的時候,，就將培養(yǎng)基,、酶、DHANKS液那到室外讓它自然升溫,。這樣40分鐘后,，溫度也升上來了。有很多人將他放到37度水浴鍋里加熱,。一定要注意水浴鍋的衛(wèi)生,，有的常年不清洗，里面很臟,，容易在外面瓶身上吸附大量細菌,。因此用它的也一定要勤換水。從水域鍋那出后,，*好找個毛巾插干上面的水,。
（6）操作前要洗手，用75%酒精搽手,。用完操作臺,，要打掃衛(wèi)生。
人結腸腺癌細胞系,；LS123細胞要經常凍存,，我一般只要細胞狀態(tài)好就將細胞凍存起來。細胞狀態(tài)差了,，扔掉,，重新復蘇。這是一個必須養(yǎng)成的習慣,。畢竟很多情況下,，細胞并不是因為污染了，才讓你感到頭痛,。這樣你不會擔心沒有種子了,。我一般是不加雙抗的，只要注意,，不會污染,。
 

M059K星形細胞瘤分級IV細胞

過濾時不要用槍吹細胞!! 如果用力吹,篩網就像刀片一樣,把你的細胞全部切碎!!

刷玻璃器皿的過程：初洗、泡酸（一天）,、自來水沖洗（10遍）,、純化水沖洗（3遍）、注射用水沖洗（3遍）,。感覺過于苛刻,，自來水只沖洗3遍,。被老師發(fā)現(xiàn)后，一陣痛批,，才知道這是極其關鍵的一步,，殘留的酸可能會抑制細胞生長，甚至導致細胞死亡,，痛失辛苦得來的細胞,，心血付之東流。無知不能無畏,，一定不能大意,。

做好準備工作。不要急于投身到人結腸腺癌細胞系,；LS123細胞細胞培養(yǎng)中去,，要先設定計劃：步驟，工具,，試劑,。特別是將細胞用于大規(guī)模生產時，尤其如此,。eg.經過干熱滅菌的容器一般認為可以在一周內保持無菌狀態(tài),，如果準備多了，用不完的就得重新滅菌,，耗費能源、占用滅菌空間,，不值得,；干熱滅菌需要一天的時間，當器皿準備不足時,，只能干著急,，錯過了*佳操作時間，也許得很久才能將細胞狀態(tài)再調整好,。

對于驕氣的細胞,，我一般都是*天處理完后，加少量培基（夠蓋住瓶底部）,，第二天換液,，以免死細胞和碎片對活的產生不良影響。

新配的培養(yǎng)基直接用很清亮,，但是在－20度保存一段時間后再溶解就要出現(xiàn)很多雜質,，用37度水孵育沒有效果，握在手里不停搖動非常有效,。其實對于操作熟練的人來說,，污染并不是我們想像那樣容易出現(xiàn),，園子里很多人都問否污問題，而培養(yǎng)基的PH值往往被忽略,，而且大多數(shù)人都習慣于一次配制1升培養(yǎng)基,，分裝成10X100ml，用1瓶,，另外9瓶放在－20度保存,，很容易出現(xiàn)結晶，鏡下看就是一些桿狀的物資,，有時候晃動培養(yǎng)基,，肉眼就可以看到很多沉淀，這就需要我們在用之前好好搖勻了,。
凍存： 當人結腸腺癌細胞系,；LS123細胞細胞狀態(tài)好，或者代數(shù)比較早,，一定要大量凍存,，不要吝惜暫時的大批使用血清，當細胞狀態(tài)不好,，長不起來的時候,，馬上取出來復蘇，省時省力,，不要去嘗試努力恢復狀態(tài)不好的細胞,，費時間也費血清，會令你痛苦不堪,。另外凍存的細胞不要放到一個地方,，－80度，液氮（甚至不同的液氮罐）都放一點,，誰也不敢保證不出意外,，冰箱也可能有化的時候（我們－20度冰箱就化過），都放在一塊容易全軍覆沒,。 

按照試劑的保存標準保存,，象血清、胰酶等沒開封的-20℃,，開封后-4℃保存一般不超過7天（用完它吧,，不然浪費了）
5、一定要弄清楚每個組分的作用,，特點,，比如NaHCO3容易分解，因此培養(yǎng)基在過濾除菌時pH會上升,，一般是0.1-0.3,，所以在過濾之前,，要把培養(yǎng)基的pH調低0.1-0.3。如果你不了解NaHCO3容易分解的特點,，就不會做相應的處理,，那么培養(yǎng)基不符和要求，細胞就長不好
臺盼藍主要用來鑒定原代培養(yǎng)細胞時,細胞分離后的存活情況,，用0.4%臺盼藍直接染色5-10分鐘,，在顯微鏡下觀察即可，活細胞不被染色,。方便易用,，因此在實驗室中比較常用，尤其在心肌細胞原代培養(yǎng)中,。