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流感病毒基因序列變異的NGS監(jiān)測(cè)方法
流感病毒感染包括人類在內(nèi)的許多鳥類和哺乳動(dòng)物,，并且由這些病毒引起的感染具有重大的公共衛(wèi)生,，動(dòng)物衛(wèi)生和經(jīng)濟(jì)意義,。甲型流感病毒（IAV）在遺傳和抗原上都極為多樣化,，并廣泛分布于的野生禽類,，家禽和哺乳動(dòng)物以及人類中,。有兩種主要的表面糖蛋白，血凝素和神經(jīng)氨酸酶,，具有多種亞型,。在144種可能的HA-NA亞型組合中，至少有131種已在NCBI流感病毒數(shù)據(jù)庫中從禽類中分離出來的菌株中進(jìn)行了確認(rèn),。對(duì)流感的監(jiān)測(cè)，快速診斷,，傳播,，發(fā)病機(jī)制和疫苗學(xué)的持續(xù)研究對(duì)于預(yù)防和減輕其影響至關(guān)重要。
流感研究的一個(gè)關(guān)鍵方面是檢測(cè)流感病毒的類型,，亞型和基因型,，并對(duì)其進(jìn)行分類，特別是對(duì)于不同樣本（例如野生鳥類，家畜和人類患者）中新出現(xiàn)的病毒變異要進(jìn)行監(jiān)測(cè),，預(yù)防和治療,。技術(shù)進(jìn)步允許開發(fā)新的方法來鑒定來自各種樣品類型的流感病毒分離株，包括基于培養(yǎng),，抗體結(jié)合,，血清學(xué)測(cè)定，基因擴(kuò)增和基因測(cè)序方法,。比較全面的檢測(cè)方法仍然是采用高通量測(cè)序技術(shù),。由于典型臨床樣品中病毒RNA的數(shù)量較低，所有這些研究都采用了病毒特異性引物和病毒特異性PCR擴(kuò)增策略來捕獲目標(biāo)流感序列,。然而近在下一代測(cè)序（NGS）中越來越多地強(qiáng)調(diào)PCR引入的錯(cuò)誤,。目前已經(jīng)顯示常用的PCR酶，包括高保真酶,，均具有10-5至10-6點(diǎn)突變/ bp /重復(fù)的錯(cuò)誤率,。除了特征明確的聚合酶堿基取代錯(cuò)誤外，還發(fā)現(xiàn)其他錯(cuò)誤同樣普遍,，包括PCR介導(dǎo)的重組,，模板轉(zhuǎn)換和溫度循環(huán)過程中引入的DNA損傷。使用PCR捕獲源自流感病毒RNA的cDNA的另一個(gè)挑戰(zhàn)是分離的流感RNA可能已被降解,，因此難以通過需要全長(zhǎng)片段作為模板的流感通用引物進(jìn)行擴(kuò)增,。在許多場(chǎng)合下，無法使用亞型特異性引物,，因?yàn)闃悠分辛鞲胁《镜念愋突騺喰褪俏粗摹?/p>
美國NIH設(shè)計(jì)了一種針對(duì)所有流感病毒株的捕獲探針,。利用所有可用的甲型，乙型和丙型流感病毒序列,，獲得了用于設(shè)計(jì)通用流感捕獲探針集,。但探針捕獲的前提是需要有足夠的cDNA才可以實(shí)現(xiàn)，同時(shí)避免使用PCR引入的錯(cuò)誤,。 因此,，美國NIH采用了Nugen公司的Ovation RNA-seq V2試劑盒來富集病毒的cDNA。 該試劑采用了Ribo-SPIA技術(shù),，只需4.5小時(shí),，即可從500 pg-100 ng的 總RNA中獲得高質(zhì)量的cDNA樣品。對(duì)于降解的樣本（如RIN 2.4）的樣本,，同樣會(huì)給出驚喜的結(jié)果,。Ovation RNA-Seq System V2以簡(jiǎn)化的工作流程提供了更高的轉(zhuǎn)錄本覆蓋和均一的測(cè)序序列分布。 SPIA技術(shù)是取代PCR擴(kuò)增的一種技術(shù),，其原理是單引物的擴(kuò)增,， 同時(shí)擴(kuò)增保證每次的模板是樣品模板,，不同于PCR擴(kuò)增模板可能是上一輪的擴(kuò)增產(chǎn)物。 SPIA擴(kuò)增產(chǎn)物無偏向,，可用于基因表達(dá)差異分析,，因此可呈現(xiàn)樣品的原始比列狀態(tài)。將該方法應(yīng)用于從野鳥場(chǎng)監(jiān)視收集的泄殖腔拭子樣品中,，發(fā)現(xiàn)這些樣品中的IAV序列和亞型是傳統(tǒng)方法無法檢測(cè)到的,。
隨后，NIH使用病毒靶向雜交捕獲對(duì)來自接受GMP制成的A型流感/加利福尼亞/ 04/2009（H1N1）攻擊的15位志愿者和5位2009年大流行的自然感染流感患者的鼻洗樣本進(jìn)行了深度測(cè)序,。在挑戰(zhàn)病毒中發(fā)現(xiàn)了十個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP）位置,。在攻擊患者和自然感染患者中發(fā)現(xiàn)了許多SNP位點(diǎn)，其中許多以前未發(fā)現(xiàn),。鑒定出的SNP和進(jìn)化樹分析表明,，在挑戰(zhàn)參與者和自然感染的患者中病毒的宿主內(nèi)部進(jìn)化是不同的。這項(xiàng)研究使用PCR Free的雜交捕獲技術(shù),，提供了一種準(zhǔn)確無偏的評(píng)估方法,，用于評(píng)估人體內(nèi)從統(tǒng)一的流感接種劑到宿主體內(nèi)不同病毒的進(jìn)化，并與自然感染的患者進(jìn)行比較,。