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宏轉(zhuǎn)錄組用于監(jiān)測蟲媒病毒的研究
宏轉(zhuǎn)錄組學（總RNA測序）可實現(xiàn)樣品中病毒的非靶向,，高通量檢測和鑒定,。它可以用于檢測已知病毒和新型病毒,，同時提供完整的基因組信息,，使其成為功能強大的監(jiān)測工具,。宏轉(zhuǎn)錄組學已用于多種監(jiān)測項目,，包括檢測人類污水中的病毒,，監(jiān)測無脊椎動物中間宿主（例如蜱）和脊椎動物中間宿主（如蝙蝠）中的病毒，以及在爆發(fā)期間溯源病毒株,。宏轉(zhuǎn)錄組學在一系列監(jiān)測應(yīng)用中的成功應(yīng)用表明它具有提高當前蟲媒病毒（節(jié)肢動物傳播的病毒）監(jiān)測程序的潛力,。
蟲媒病毒對人類和動物健康構(gòu)成重大威脅，其中包括登革熱,，黃熱病,，寨卡病毒，基孔肯雅熱,，藍舌病和馬腦炎病毒等病原體,，僅登革熱病毒每年就感染約3.9億人。病毒監(jiān)測可作為增加傳播風險的預(yù)警系統(tǒng),，并采用諸如誘捕蚊子,，在細胞培養(yǎng)中分離病毒以及使用定量PCR（qPCR）分析進行靶向分子病毒檢測等手段。宏轉(zhuǎn)錄組學是一種非靶向方法,，為蟲媒病毒監(jiān)測提供了許多優(yōu)勢,。它可以在不進行培養(yǎng)的情況下檢測病毒，不需要先確定病毒序列,，可以識別新的蟲媒病毒威脅,，闡明混合感染，并可以為暴發(fā)的分子流行病學調(diào)查提供完整的基因組序列或特定的蛋白質(zhì)序列,。此外,，它可以檢測蚊子群中的其他生物，包括共生菌和寄生蟲（如利什曼原蟲）,。
為了將轉(zhuǎn)錄組學用于蟲媒病毒監(jiān)測,，必須首先認證監(jiān)測蚊子群方法的敏感性和特異性。許多研究已經(jīng)使用宏轉(zhuǎn)錄組學方法通過Illumina,，Ion Torrent和Oxford Nanopore測序來檢測單個蚊子中的病毒,。更多的研究是對蚊子群體進行測序，群體的樣本數(shù)從5個到6700個標本不等,。這些研究主要集中在探索各種蚊子種群中存在的病毒多樣性,。但是,，大量蚊子用于蟲媒病毒監(jiān)測時，缺乏有關(guān)宏轉(zhuǎn)錄組學金標準測試指標（例如敏感性和特異性）的研究,。在評估傳播風險和了解病毒豐度的時間變化時,，這一點至關(guān)重要。病毒載量和測序結(jié)果之間的關(guān)系需要明確,，以避免對序列數(shù)據(jù)的錯誤解讀,，從而導致假陽性結(jié)果（檢測到蚊子群中不存在病毒）和蚊子群中存在的病毒的假陰性結(jié)果（檢測失敗）,。
實驗室工作流程會大大影響宏轉(zhuǎn)錄組測序檢測蚊子中蟲媒病毒的能力,。一種提高靈敏度的流行方法是使用過濾，PEG沉淀或不依賴序列的擴增方法來富集蟲媒病毒,。盡管這確實增加了病毒序列的數(shù)量,，但富集也會引入偏向bias。增加病毒序列數(shù)量的另一種方法是消耗蚊子RNA,，通常是靶向豐富的核糖體RNA（rRNA）去除,。有多種rRNA去除試劑盒可采購，但是這些試劑盒并非特定于蚊子的,，因此需要采用基于蚊子rRNA序列的定制探針,。
來自澳大利亞的科學家采用Nugen的蚊媒RNA測序文庫構(gòu)建試劑盒（特異性去除蚊子rRNA探針）驗證了高通量基因測序（NGS）技術(shù)蚊子中蟲媒病毒的敏感性和特異性。為了對此進行評估,，將羅斯河病毒（RRV）和Umatilla病毒（UMAV）分離株的五種稀釋度（1：1,、1：20、1：400,、1：8,000和1：160,000）摻入100個樣本群的子樣本中南方庫蚊（Culex australicus）蚊子,。 1：1稀釋表示100只蚊子池中一只RRV感染的蚊子的病毒載量?？茖W家對子樣本進行了核酸提取,，蚊子特異性核糖體RNA去除和Illumina HiSeq測序?？茖W家還使用數(shù)字PCR（RT-ddPCR）和定量PCR（RT-qPCR）測量了子樣品的病毒載量,。轉(zhuǎn)錄組測序在1：1、1：20和1：400子樣本中檢測到RRV和UMAV,。正確識別了100％的RRV和99.6％的UMAV組裝序列,，實現(xiàn)了高特異性。宏轉(zhuǎn)錄組測序不如RT-qPCR或RT-ddPCR靈敏,，但是它得到了全基因組序列并檢測到其他19種病毒，其中包括澳大利亞的四次*發(fā)現(xiàn)的病毒,。這些發(fā)現(xiàn)將有助于蟲媒病毒監(jiān)測計劃在常規(guī)監(jiān)測活動中利用轉(zhuǎn)錄組學來加強蟲媒病毒的檢測,。
之后,，澳大利亞科學家采用這種方法在蚊子中發(fā)現(xiàn)了Yada病毒。
