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凍干工藝及保護(hù)劑對羥基喜樹堿脂質(zhì)體質(zhì)量的影響
摘要：用薄膜水化- 高壓均質(zhì)法制備羥基喜樹堿脂質(zhì)體，以葡聚糖凝膠色譜法分離脂質(zhì)體和游離藥物,，采用HPLC 法測定包
封率,。通過差示掃描量熱法測定含不同保護(hù)劑的脂質(zhì)體的zui低共熔點(diǎn)和玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，并比較凍干品外觀,、凍干前后脂質(zhì)
體包封率和粒徑的變化,，優(yōu)選出*的凍干工藝、凍干保護(hù)劑種類及比例,。結(jié)果表明,，以6％蔗糖為凍干保護(hù)劑，經(jīng)4 ℃,、1 h,，
-18 ℃、12 h 和-35 ℃,、5 h 逐步預(yù)凍,，然后于-54 ℃冷凍干燥24 h，制得的凍干品外觀良好,，脂質(zhì)體復(fù)溶后粒徑變化小,，包
封率達(dá)(87.0±2.7)％。
關(guān)鍵詞：羥基喜樹堿；脂質(zhì)體,；凍干工藝,；凍干保護(hù)劑
中圖分類號：R944.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8255(2012)01-0030-05
羥基喜樹堿(10-hydroxycamptothecine，1) 是
喜樹堿類的衍生物,，屬于拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ抑制劑,，廣
泛用于治療原發(fā)性肝癌,、胃癌,、頭頸癌、膀胱癌等,，
療效明顯,，不良反應(yīng)較少。由于1 不溶于水,，易溶
于稀堿溶液,，主要通過氫氧化鈉堿化開環(huán)制成鈉鹽
注射液、粉針劑應(yīng)用于臨床,，雖增加了水溶性,，但
破壞了1 的六元α- 羥基內(nèi)酯環(huán)的完整性，抗腫瘤
*降低[1,2],。
采用脂質(zhì)體技術(shù)包裹1,，可改善1 的溶解性并
保護(hù)1 的內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu),，但脂質(zhì)體在水性環(huán)境中易發(fā)
生粒子聚集,、沉降,、融合,、磷脂的氧化和水解,、藥
物滲漏等穩(wěn)定性問題,。因此,，為提高脂質(zhì)體的貯存
穩(wěn)定性,，將其制成凍干制劑以降低磷脂的水解和氧
化速度,，延長貯存時間,。凍干工藝及凍干保護(hù)劑種
類對脂質(zhì)體的質(zhì)量有重要影響，因此本研究以外觀,、
包封率和粒徑為指標(biāo),，考察二者對1 脂質(zhì)體凍干效
果和復(fù)溶后性質(zhì)的影響，優(yōu)化1 脂質(zhì)體的凍干保護(hù)
劑及凍干工藝,，為其工業(yè)生產(chǎn)提供參考,。
1 儀器和試藥
1100 型液相色譜儀、G1314A 型紫外檢測器( 美
國Agilent 公司) ,；Zetasizer Nano ZS90 型納米粒度分析儀
( 英國Malvern 公司) ,；DSC-204 型差示掃描量熱儀( 德國
Netzsch 公司) ；EmulsiFlex-C3 型納米高壓均質(zhì)機(jī)( 加拿大
Avestin 公司) ；ALPHA 1-4 LD plus 型冷凍干燥機(jī)( 德國
Christ 公司),。
1 原藥( 成都天源天然產(chǎn)物有限公司,，含量98.3 ％，
批號080701) ,；大豆磷脂S100( 德國Lipoid 公司) ,；1 對照
品( 中國食品藥品檢定研究院，批號200301) ,；Sephadex
G-75(Amersham Biosciences 公司) ,；膽固醇( 分析純，廣州
天馬精細(xì)化工廠) ,；乳糖( 藥用級,，荷蘭DMV 有限公
司) ；甘露醇( 注射級,，廣西南寧化學(xué)制藥有限責(zé)任公司) ,；
葡萄糖( 分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠),；蔗糖( 藥用級,，
湖南爾康制藥有限公司) ；麥芽糖( 注射級,，日本食品化工
株式會社) ,；山梨醇( 注射級，中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑
公司) ,；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純,。
2 方法與結(jié)果
2.1 1 脂質(zhì)體凍干品的制備
采用薄膜水化- 高壓均質(zhì)方法,。取1 400 mg、
大豆磷脂4 g 與膽固醇500 mg 置茄形瓶中,，加無
水乙醇- 二氯甲烷( 1 ∶ 2) 混合液使溶解,，40 ℃
旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至成膜，減壓干燥過夜,。加磷酸鹽緩沖液
(PBS,，pH 6.0) 室溫水化，所得乳白色的混懸液經(jīng)
高壓均質(zhì)機(jī)均化(均化壓力為15 000 psi),，循環(huán)4次,，
加入凍干保護(hù)劑，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾,，濾液
分裝于西林瓶中,，然后經(jīng)4 ℃ (1 h),、-18 ℃ (12 h)
和-35 ℃ (5 h) 分步預(yù)凍后，置冷阱溫度為-54 ℃,、
真空度為0.34 mbar 的冷凍干燥機(jī)中,，冷凍干燥24 h，
即得1 脂質(zhì)體凍干品,。同法制備不含1 的空白脂質(zhì)
體混懸液,。
2.2 1 脂質(zhì)體凍干前后粒徑的測定
取1 脂質(zhì)體混懸液，以水為分散介質(zhì)稀釋至適
當(dāng)倍數(shù)( 凍干品則加水復(fù)溶并稀釋),，測定粒徑,。
2.3 1 脂質(zhì)體凍干品復(fù)溶時間的測定
取1 脂質(zhì)體凍干品，加水復(fù)溶,，記錄塊狀物溶
解并形成脂質(zhì)體混懸液的時間,。
2.4 1 脂質(zhì)體包封率的測定
2.4.1 色譜條件及凝膠色譜條件
采用HPLC 法測定1 的含量[ 3]。色譜條件：
色譜柱 Kromasil C18 柱(4.6 mm×250 mm,，5 μm)；
流動相 甲醇- pH 6.5 PBS(50 ∶ 50) ,；檢測波長
266 nm ,；流速 1.0 ml/ min ；柱溫 35 ℃ ,；進(jìn)樣量
20 μl,。
利用1 不溶于水而易溶于0.1 mol/L 氫氧化鈉
溶液的特性，采用Sephadex G-75 凝膠色譜法分離
脂質(zhì)體與游離1,。采用梯度洗脫：先用pH 6.0 PBS
將載藥脂質(zhì)體*洗脫,，然后用0.1 mol/L 氫氧化
鈉溶液(pH 12.0) 洗脫，截留在柱子頂端的1 溶
解成一黃色環(huán)帶,，并逐步被洗脫,。洗脫曲線見圖
1。結(jié)果表明用pH 6.0 PBS 15 ml 洗脫后脂質(zhì)體已
*被洗出,，游離藥物和脂質(zhì)體能達(dá)到較好分離,。
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
0 10 20 30 40 50 60 70
- 載藥脂質(zhì)體； ◆- 游離1
洗脫體積/ml
圖1 載藥脂質(zhì)體及游離1 洗脫曲線圖
2.4.2 包封率的測定
取1 脂質(zhì)體混懸液100 μl,，上SephadexG-75
凝膠柱,，用pH 6.0 PBS 洗脫，收集前15 ml,，置
25 ml 量瓶中,，加入甲醇8 ml 超聲破乳后定容，取
樣測定,，得包封在脂質(zhì)體中的藥量,。另取1 脂質(zhì)體
混懸液100 μl 置25 ml 量瓶中，加入甲醇20 ml 超
聲破乳后定容，取樣測定得總藥量,。計(jì)算1 脂質(zhì)體
包封率,。
精密稱取1 對照品10 mg 置100 ml 量瓶中，
用甲醇溶解并定容,，精密量取2 ml 置50 ml 量瓶,，
用流動相定容得4 μg/ml 的1 對照品溶液。分別取
空白脂質(zhì)體和1 脂質(zhì)體混懸液100 μl 置25 ml 量
瓶中,，加入甲醇20 ml 超聲破乳后定容,，即得空白
脂質(zhì)體樣品溶液和1 脂質(zhì)體樣品溶液。取上述3 種
溶液分別進(jìn)樣測定,，典型色譜圖見圖2,。以峰面積
A 對1 濃度c 進(jìn)樣線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為
A=8 572.60c-918.77,，r=0.999 5,，線性范圍為0.04 ～
30 μg/ml ；平均回收率為(101.50±1.62)％ (n=9) ,；凝
膠柱色譜法分離游離1 的回收率為(99.15±1.60)％
(n=9) ,；1 脂質(zhì)體的回收率為(102.80±1.10)％ (n=9)，
表明使用HPLC 法測定1 的含量準(zhǔn)確度好,，用凝膠
色譜柱方法分離脂質(zhì)體和游離藥物的分離度高,，準(zhǔn)
確度好。
A B
A ：1對照品溶液( ml ),，B：1脂質(zhì)體樣品溶液(3 ml)
1-1
mAU
140
120
100
80
60
40
20
0
0 2 4 6 8 10
t/min
1
mAU
140
120
100
80
60
40
20
0
0 2 4 6 8 10
t/min
1
圖2 典型色譜圖
2.5 凍干工藝的考察
2.5.1 zui低共熔點(diǎn)和玻璃化轉(zhuǎn)變溫度的測定
預(yù)凍溫度應(yīng)低于藥液的zui低共熔點(diǎn),，否則樣
品凍結(jié)不實(shí)，在減壓升華時會膨脹起泡或藥液噴
瓶,。在凍干過程中,，控制溫度低于樣品的玻璃化
轉(zhuǎn)變溫度，可得到結(jié)構(gòu)疏松,、表面美觀,、復(fù)溶后
粒徑變化小的凍干脂質(zhì)體[ 4]。本研究利用差示掃
描量熱(DSC) 法測定了選用不同凍干保護(hù)劑( 蔗
糖,、葡萄糖,、麥芽糖、乳糖,、甘露醇和山梨醇)
制備的1 脂質(zhì)體的zui低共熔點(diǎn)和玻璃化轉(zhuǎn)變溫度,，
結(jié)果見表1。
預(yù)試驗(yàn)分別考察了-18 ℃和-80 ℃預(yù)凍12 h 后
再進(jìn)行冷凍干燥的效果,，結(jié)果表明經(jīng)-18 ℃預(yù)凍
后,，樣品在凍干過程中的“沸騰”現(xiàn)象嚴(yán)重,，凍
干產(chǎn)品表面凹凸不平甚至鼓泡。而采用-80 ℃預(yù)
凍得到的凍干品表面呈光滑的玻璃狀,，復(fù)溶后為
類白色混懸液,，但有藥物結(jié)晶析出，提示制品的
包封率已嚴(yán)重下降,，原因可能是直接采用-80 ℃
表1 含不同凍干保護(hù)劑的脂質(zhì)體zui低共熔點(diǎn)與玻璃
化轉(zhuǎn)變溫度,，n=3)
種類zui低共熔點(diǎn)/℃ 玻璃化轉(zhuǎn)變溫度/℃
甘露醇-13.8±0.2 -49.8±0.1
麥芽糖-21.3±0.1 -41.5±0.2
乳糖-22.6±0.2 -39.8±0.1
山梨醇-23.7±0.2 -51.1±0.1
葡萄糖-25.2±0.1 -50.1±0.3
蔗糖-28.7±0.1 -45.5±0.2
預(yù)凍，制品的降溫速率太快,，在快速冷凍時,，冰晶
從瓶底向上生長形成枝狀冰晶，溶質(zhì)在冷凍過程中
遷移到頂部,，導(dǎo)致無定形溶質(zhì)在凍干品頂部形成近
乎封閉的一層[5],。根據(jù)上述測定結(jié)果及預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，
選擇預(yù)凍溫度為-35 ℃,，凍干溫度為-54 ℃,。
2.5.2 預(yù)凍速度的考察
預(yù)凍速度即降溫速度，是冷凍過程中的一個
重要參數(shù),，對產(chǎn)品的質(zhì)量影響較大[ 6,7],。本研究參
考文獻(xiàn)[ 8] 并略加改進(jìn)，將加入蔗糖作為凍干保護(hù)
劑的樣品進(jìn)行慢凍( 即分步預(yù)凍：4 ℃放置1 h,，
-18 ℃預(yù)凍12 h，-35 ℃預(yù)凍5 h) 或速凍( 直接
-35 ℃預(yù)凍12 h) 后再于-54 ℃凍干24 h,，考察預(yù)
凍速度對產(chǎn)品質(zhì)量的影響,。結(jié)果表明，兩種方式
得到的凍干品外觀均為類白色疏松塊狀物,，但復(fù)
溶后溶液的狀態(tài)差別顯著,。采用速凍方式的凍干
品，復(fù)溶后可見淡黃色的顆粒沉淀,，慢凍的產(chǎn)品
復(fù)溶后外觀為均勻的類白色混懸液,。主要原因可
能是速凍過程會形成較多尺寸較小的細(xì)晶，造成
脂質(zhì)體膜的損傷,，使部分1 在凍干品復(fù)溶后析出,。
而慢凍過程易形成大顆粒的冰晶，減少冰晶嵌入
脂質(zhì)體雙層膜致其受損的幾率,。因此,，選擇慢凍
方式即分步預(yù)凍。
2.5.3 凍干保護(hù)劑的加入方式
凍干保護(hù)劑在脂質(zhì)膜的內(nèi)水相和外水相平衡,，
才能對脂質(zhì)體起到保護(hù)的作用,。如保護(hù)劑只存在
于膜內(nèi)或膜外,，則無法起到足夠的保護(hù)作用[ 9,10]。
本研究比較了內(nèi)加法( 在脂質(zhì)體制備過程中將保
護(hù)劑加至水相介質(zhì)中) 和外加法( 制備好脂質(zhì)體
混懸液后再加入保護(hù)劑) 對凍干產(chǎn)品的影響,。
表2 凍干保護(hù)劑加入方式對凍干脂質(zhì)體的
影響1) ,，n=3)
方法
凍干前
粒徑/nm
凍干后
復(fù)溶粒徑/nm
凍干前
包封率/％
凍干后
包封率 /％
內(nèi)加法192±2.6 195±3.3 82.7±2.3 81.4±1.9
外加法198±1.8 196±2.2 83.2±3.4 82.8±2.5
注：1) 兩種方式得到的凍干品外觀均為類白色疏松塊狀物
結(jié)果表明，保護(hù)劑的加入方式對產(chǎn)品的外觀及
包封率影響不大,，兩者沒有顯著差異,。
結(jié)果表明，以蔗糖和麥芽糖作為1 脂質(zhì)體的凍
干保護(hù)劑,，凍干前后的粒徑和包封率均無明顯變化,，
凍干品外觀良好。但目前國內(nèi)注射級麥芽糖須從日
本進(jìn)口,，價(jià)格昂貴,。因此，選擇以蔗糖為1 脂質(zhì)體
的凍干保護(hù)劑,，并進(jìn)一步考察*的保護(hù)比例,。
2.5.5 不同濃度蔗糖對脂質(zhì)體的保護(hù)作用
考察了蔗糖濃度分別為1％、2％,、4％,、6％、
8％和10％時對脂質(zhì)體的保護(hù)作用,，以確定*的
保護(hù)比例,。結(jié)果見表4。
表4 不同濃度蔗糖對1 脂質(zhì)體的保護(hù)作用1)
,，n=3)
蔗糖濃度/％ 粒徑/nm 包封率/％
凍干前凍干后凍干前凍干后
1 192±4.6 958±2.3 85.8±1.5 7.0±0.3
2 208±1.8 224±1.2 87.5±1.6 63.2±2.7
4 191±2.2 197±4.4 86.5±2.3 84.6±1.9
6 197±3.7 186±3.6 87.3±2.3 87.0±2.7
8 193±4.5 188±2.5 87.6±1.9 83.4±1.4
10 191±3.4 180±3.1 86.3±1.8 81.1±1.0
注：1) 所得脂質(zhì)體凍干后均為類白色疏松塊狀物
由表4 可見,，蔗糖濃度達(dá)到6％時保護(hù)作用zui
2.5.4 不同凍干保護(hù)劑對脂質(zhì)體的保護(hù)作用
按“2.1”項(xiàng)下方法制備不含凍干保護(hù)劑的1
脂質(zhì)體，然后采用外加法加入各凍干保護(hù)劑后凍
干,。以脂質(zhì)體凍干后的外觀,、復(fù)溶時間、粒徑和
包封率為評價(jià)指標(biāo),，篩選凍干保護(hù)劑種類,。考察
了6 種常用的凍干保護(hù)劑：山梨醇,、蔗糖,、甘露
醇、乳糖,、葡萄糖和麥芽糖[ 7],，濃度均為10 ％。
結(jié)果見表3,。
表3 不同凍干保護(hù)劑對1 脂質(zhì)體的保護(hù)作用,，n=3)
保護(hù)劑復(fù)溶時間/s 粒徑/nm 包封率/％ 凍干后外觀
凍干前凍干后凍干前凍干后
無20±1.3 199±1.9 1 060±3.2 87.2±2.0 2.7±0.1 類白色萎縮物
甘露醇82±4.2 194±4.0 1 420±2.9 86.7±2.3 6.0±0.2 類白色塊狀物
麥芽糖6±1.5 203±1.9 203±1.7 87.5±1.8 80.5±3.4 類白色塊狀物
乳糖11±3.1 186±2.1 154±1.9 86.8±1.5 47.8±2.3 類白色塊狀物
山梨醇254±2.8 202±3.6 240±2.5 85.7±2.0 20.7±0.9 類白色帶鼓泡塊狀物
葡萄糖18±0.9 196±4.9 196±2.4 88.1±1.6 53.4±1.9 類白色萎縮物
蔗糖17±1.7 194±5.7 165±2.0 87.6±2.4 83.1±2.3 類白色塊狀物
佳,。這是由于在降溫速率一定的情況下，增大保護(hù)
劑濃度能較大程度地實(shí)現(xiàn)溶液的部分玻璃化,，減少
冰晶對脂質(zhì)體膜的損傷,。但當(dāng)超過6％后，反而造
成脂質(zhì)體包封率的下降,，可能是蔗糖濃度過大時破
壞了脂質(zhì)體膜內(nèi)外的壓力平衡,，對脂質(zhì)體膜產(chǎn)生一
定的破壞作用，導(dǎo)致脂質(zhì)體破裂,。
3 討論
3.1 脂質(zhì)體的冷凍干燥應(yīng)考慮預(yù)凍的溫度和預(yù)凍的
速率,，預(yù)凍的溫度在zui低共熔點(diǎn)以下5 ～ 20 ℃為
宜，且應(yīng)避免快速冷凍,。本研究在考察了含不同保
護(hù)劑脂質(zhì)體的zui低共熔點(diǎn)的基礎(chǔ)上,，采用4 ℃放置
1 h，-18 ℃預(yù)凍12 h,，-35 ℃預(yù)凍5 h 的分步預(yù)凍
方式,，降低了預(yù)凍時的降溫速率，對脂質(zhì)體膜起到
保護(hù)作用,。
3.2 凍干保護(hù)劑的加入可降低凍結(jié)過程中脂質(zhì)體囊
泡的脫水速度和皺縮程度,，并防止冰晶對囊泡的機(jī)
械損傷，同時可提高脂質(zhì)體混懸液的玻璃化轉(zhuǎn)變溫
度,。在本研究中,，不加凍干保護(hù)劑，凍干品萎縮,，復(fù)
溶后,，粒徑顯著增大，包封率顯著下降,。而加入凍
干保護(hù)劑后，對脂質(zhì)體的包封率具有保護(hù)作用,，在
常用的保護(hù)劑中,，甘露醇的保護(hù)作用zui差，這是因
· 3 4 · 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2012, 43(1)
為甘露醇作為脂質(zhì)體保護(hù)劑具有反玻璃化現(xiàn)象[11],。
在測定各凍干保護(hù)劑的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度時,，可見甘
露醇在玻璃化轉(zhuǎn)變后有一個明顯的放熱峰，此現(xiàn)象
提示反玻璃化是甘露醇對脂質(zhì)體的凍干保護(hù)效果較
差的主要原因,。
3.3 以脂質(zhì)體凍干品的外觀,、復(fù)溶時間、粒徑和包
封率為指標(biāo),，探索了1 脂質(zhì)體的凍干工藝,。結(jié)果
表明,，以慢速在較低溫度下預(yù)凍，并采用6％的蔗
糖為凍干保護(hù)劑,，冷凍干燥24 h,，能制得外觀為類
白色疏松塊狀物的凍干品，該制品易復(fù)溶,，分散
性好,，凍干前后包封率均高于85％，平均粒徑約
200 nm,，有利于被動靶向于肝,、脾等器官。本研究
為工業(yè)生產(chǎn)脂質(zhì)體凍干品提供了參考,，但由于設(shè)備
條件所限,，冷凍的降溫速率及凍干曲線有待進(jìn)一步
探索。
參考文獻(xiàn)：
[1] Pommier Y. Topoisomerase I inhibitors: camptothecins and
beyond [J]. Nat Rev Cancer, 2006, 6(10): 789-802.
[2] 徐麗婷, 謝 華. 羥基喜樹堿的藥理作用及臨床應(yīng)用[J]. 醫(yī)
藥導(dǎo)報(bào), 2005, 21(5): 308-309.
[3] Yang L, Cui FD, Cun DM, et al. Preparation, characterization
and biodistribution of the lactone form of 10-hydroxycamptothecin
(HCPT)-loaded bovine serum albumin (BSA)
nanoparticles [J]. Int J Pharm, 2007, 340(1-2): 163-172.
[4] 劉占杰, 華澤釗, 李保國, 等. 凍結(jié)過程對脂質(zhì)體粒徑影響
的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 青島大學(xué)學(xué)報(bào), 2000, 15(3): 73-76.
[5] 托爾欽林 VP, 魏西希 V. 脂質(zhì)體[M]. 鄧意輝, 徐 暉, 譯.
北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2007: 121-124.
[6] van Winden EC, Zhang W, Crommelin DJ. Effect of freezing
rate on the stability of liposomes during freeze-drying and rehydration
[J]. Pharm Res, 1997, 14(9): 1151-1160.
[7] Chen C, Han D, Cai C, et al. An overview of liposome lyophilization
and its future potential [J]. J Controlled Release,
2010, 142(3): 299-311.
[8] 劉占杰, 肖洪海, 蘇樹強(qiáng), 等. 冷卻方式對凍干脂質(zhì)體藥物
的粒徑和包封率影響的實(shí)驗(yàn)研究[ J] . 工程熱物理學(xué)報(bào),
2002, 23(5): 599-601.
[ 9] 邱永宏, 戈延茹, 王成潤, 等. 鹽酸伊立替康脂質(zhì)體凍干
粉針的制備及其質(zhì)量評價(jià)[ J] . 江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)( 醫(yī)學(xué)版) ,
2009, 19(4): 314-319.
[10] 張陽德, 曹政科, 張 峰. 苯磺酸氨氯地平柔性納米脂質(zhì)
體凍干工藝研究[ J] . 中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志, 2009, 19(14) :
2111-2113.
[11] 李保國, 華澤釗, 劉占杰. 脂質(zhì)體冷凍干燥及其對藥品的
包封率[J]. 湖南文理學(xué)院學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2003, 15(3):