基于細胞涂色檢驗的表型分析的簡化工作流程
基于細胞涂色檢驗的表型分析的簡化工作流程
Angeline Lim, Misha Bashkurov | Molecular Devices LLC
David Egan, Victor Wong | Core Life Analytics
簡介
細胞涂色檢驗(cell painting assay)等多參數(shù)高內(nèi)涵篩選方法越來越多的被應(yīng)用到從藥物研發(fā)到功能基因組學篩選等領(lǐng)域。細胞涂色檢驗用到多達6種熒光染料在單細胞水平來標記及觀察各種細胞器,。分析中獲得的所有特點都能賦予指定的細胞的細胞表征,。另外,,通過對比新型化合物和參比化合物的表型特征能了解到作用機制,。大多數(shù)生物學家都熟悉細胞涂色檢驗所用的方法,。然而,,要想在海量的實驗數(shù)據(jù)中獲得有意義的信息還需要計算工具的輔助,。
在此,我們介紹了一種易于完成的細胞涂色檢驗的完整流程,。通過這一方法,,我們發(fā)現(xiàn)用同一種化合物處理的細胞表現(xiàn)出相同的表性特征。分層聚類分析能將紫杉醇和魚藤酮之類的高毒性化合物分到同一組,。氯喹和粉防己堿這兩種影響自噬的化合物同樣被分到同一組里,。這些結(jié)果表明此處提出的工作流程是開展高內(nèi)涵表型分析可行且可靠的方法。
方法
基于圖像的分析工作流程概述,。以下列出了每個步驟的詳細信息,。
1、U2OS細胞(ATCC)按每孔2000個細胞接種,。
2,、總共測試了11中化合物,每種化合物按照1:3梯度稀釋(共7個濃度),,每個濃度4個復(fù)孔,,同時加入合適的對照?;衔锶缦拢?/span>Ca-074-Me,,羰基氰化物間氯苯腙(CCCP),氯喹(chloroquine),,細胞松弛素D(cytochalasin D),,依托泊苷(etoposide),拉氏菌素B(latrunculin B),,雷帕霉素(rapamycin),,魚藤酮(rotenone),十字孢堿(staurosporine),,紫杉醇(paclitaxel)和粉防己堿(tetrandrine)。
3,、化合物處理24小時后,,根據(jù)Bray等人的實驗方案用細胞涂色染料對細胞進行染色。包括以下染料:MitoTracker Deep Red,,wheat-germ agglutinin/Alexa Fluor 555,,Concanavalin A/Alexa Fluor 488,phalloidin/Alexa Fluor 568,SYTO14和Hoechst 33342,。
4,、用美谷分子儀器的ImageXpress®顯微共聚焦高內(nèi)涵成像系統(tǒng)(ImageXpress® Micro Confocal High-Content Imaging System(Molecular Devices))進行圖像采集,物鏡為20× Plan Apo objective,,激發(fā)/發(fā)射濾光片如下:DAPI 377/447,,FITC 475/536,TRITC 543/593,,Texas Red 560/624,,Cy5 631/692。
5,、用IN CartaTM圖像分析軟件進行圖像分析,。選擇的280個測量值包括跟強度、紋理,、形狀,、空間關(guān)系及共定位評分相關(guān)的參數(shù)。
6,、細胞級數(shù)據(jù)已上傳至StratoMineRTM進行進一步數(shù)據(jù)分析,。簡言之就是實施了質(zhì)量控制、微孔板正規(guī)化,、數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換以及特征標準化,。用主成分分析(principal component analysis,PCA)降低數(shù)據(jù)集的維度,。進一步的下游分析,,例如命中選擇及聚類分析,則基于主成分和推導的表型距離評分,。
結(jié)果
血管生成建模
在我們的模型檢測中,,U2OS細胞用11種化合物處理24小時,之后按照以前發(fā)表的實驗方案處理,。用ImageXpress顯微共聚焦系統(tǒng)進行細胞成像(圖1),。
圖1. 細胞涂色檢驗。細胞經(jīng)化合物處理,,染色然后成像,。對照孔各個采集通道的成像示例。最后一個圖片展示了肌動蛋白,、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細胞核的復(fù)合圖像,。
特征提取
使用IN Carta軟件,可調(diào)整圖像分析程序以實現(xiàn)細胞及細胞器的可靠檢測(圖2),。深度學習語義分割模塊(SINAP)可以用來提升挑戰(zhàn)性特征的檢測,。預(yù)訓練的深度學習模型可用來檢測細胞核或細胞,。或者,用戶也可以根據(jù)自己感興趣的特定對象來訓練新的模型,。
圖2. IN Carta軟件中的特征提取,。A)在IN Carta軟件中建立分析實驗方案來分割各個細胞結(jié)構(gòu)。此處我們用內(nèi)置的細胞核模型實現(xiàn)了所有處理的細胞核的有效分割,。其他細胞特征包括細胞質(zhì)區(qū)域,、肌動蛋白絲網(wǎng)絡(luò)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體也得到了分割,。在設(shè)定分析時選擇了跟強度,、紋理、共定位和形狀相關(guān)的測量值,。在實驗方案中我們共選擇了細胞及亞細胞結(jié)構(gòu)的280個測量值,。B)IN Carta軟件中帶有特征掩飾疊加的圖像示例。
數(shù)據(jù)分析工作流程
將IN Carta軟件中獲得的測量值上傳至HC StratoMineR進行進一步數(shù)據(jù)分析(圖3),。
圖3A-B. 利用HC StratoMineR進行數(shù)據(jù)分析,。A)HC StratoMineR是一個基于網(wǎng)絡(luò)的平臺,能通過典型的工作流程指導用戶進行高內(nèi)涵多參數(shù)數(shù)據(jù)分析,。B)QC步驟的散點圖,。X軸代表了所有樣本,Y軸代表了選中的特征(細胞核區(qū)域),。
圖3C-D. 利用HC StratoMineR進行數(shù)據(jù)分析,。C)主成分分析(廣義加權(quán)最小二乘法)將數(shù)據(jù)減低至15個成分。對PCA4的特征貢獻以極坐標圖顯示,。D)3D散點圖顯示了數(shù)據(jù)點與3種不同PCA之間的互作,。
表型特征比較-聚類
距離分數(shù)根據(jù)選定的主成分分數(shù)進行計算。這一分數(shù)代表了樣本與陰性對照之間的表型距離,,能用于篩選分析中的命中選擇,。隨后,可基于選中的特征或成分進行分層聚類分析,。
用同一種化合物處理的細胞聚類到一起(圖4A,,簇9,10)。已知具有相似細胞效應(yīng)的化合物也聚類到一起,。肌動蛋白聚合抑制劑細胞松弛素D和拉氏菌素B共同存在于簇6中,。在自噬信號通路中有作用的粉防己堿和氯喹也聚類到一起(圖4B)。
圖4. 聚類分析,。A)樹狀圖代表了分層關(guān)系,。屬于相同簇的孔(編號)用彩條表示。每個孔基于距離分數(shù)的p值展示了出來,。注意,,簇9僅由十字孢堿處理的細胞組成,而簇10僅由依托泊苷處理的細胞組成,。B)屬于某些簇的化合物處理的細胞示例,。簇5由粉防己堿和氯喹處理的細胞組成。兩者處理的孔中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)點都有增加,。簇4由魚藤酮和紫杉醇處理的細胞組成,,這些孔中的部分細胞有起泡出現(xiàn)。表明了細胞毒性作用,。
基于表型特征的劑量-反應(yīng)建模
圖5. 劑量-反應(yīng)曲線,。使用從命中選擇步驟獲得的表型距離分數(shù)繪制IC StratoMineR中每一種化合物劑量反應(yīng)曲線。Y軸代表了表型距離,,X軸代表濃度,。
結(jié)論
我們的結(jié)果表明利用ImageXpress顯微共聚焦系統(tǒng)、IN Carta軟件和StratoMineR實現(xiàn)基于圖像的分析的可行性,。
IN Carta軟件結(jié)合了易用性及更高級的特征分割選項(SINAP),,可實現(xiàn)細胞特征的可靠分割。
StratoMineR平臺允許非專家用戶根據(jù)直觀的引導式工作流程進行快速的表型數(shù)據(jù)分析,。
參考文獻
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