基于細胞涂色檢驗的表型分析的簡化工作流程

Angeline Lim, Misha Bashkurov | Molecular Devices LLC

David Egan, Victor Wong | Core Life Analytics

簡介

細胞涂色檢驗（cell painting assay）等多參數(shù)高內(nèi)涵篩選方法越來越多的被應(yīng)用到從藥物研發(fā)到功能基因組學篩選等領(lǐng)域。細胞涂色檢驗用到多達6種熒光染料在單細胞水平來標記及觀察各種細胞器,。分析中獲得的所有特點都能賦予指定的細胞的細胞表征,。另外,，通過對比新型化合物和參比化合物的表型特征能了解到作用機制,。大多數(shù)生物學家都熟悉細胞涂色檢驗所用的方法,。然而,，要想在海量的實驗數(shù)據(jù)中獲得有意義的信息還需要計算工具的輔助,。

在此，我們介紹了一種易于完成的細胞涂色檢驗的完整流程,。通過這一方法,，我們發(fā)現(xiàn)用同一種化合物處理的細胞表現(xiàn)出相同的表性特征。分層聚類分析能將紫杉醇和魚藤酮之類的高毒性化合物分到同一組,。氯喹和粉防己堿這兩種影響自噬的化合物同樣被分到同一組里,。這些結(jié)果表明此處提出的工作流程是開展高內(nèi)涵表型分析可行且可靠的方法。

方法

基于圖像的分析工作流程概述,。以下列出了每個步驟的詳細信息,。

1、U2OS細胞（ATCC）按每孔2000個細胞接種,。

2,、總共測試了11中化合物，每種化合物按照1:3梯度稀釋（共7個濃度）,，每個濃度4個復(fù)孔,，同時加入合適的對照?；衔锶缦拢?/span>Ca-074-Me,，羰基氰化物間氯苯腙（CCCP），氯喹（chloroquine）,，細胞松弛素D（cytochalasin D）,，依托泊苷（etoposide），拉氏菌素B（latrunculin B）,，雷帕霉素（rapamycin）,，魚藤酮（rotenone），十字孢堿（staurosporine）,，紫杉醇（paclitaxel）和粉防己堿（tetrandrine）。

3,、化合物處理24小時后,，根據(jù)Bray等人的實驗方案用細胞涂色染料對細胞進行染色。包括以下染料：MitoTracker Deep Red,，wheat-germ agglutinin/Alexa Fluor 555,，Concanavalin A/Alexa Fluor 488，phalloidin/Alexa Fluor 568，SYTO14和Hoechst 33342,。

4,、用美谷分子儀器的ImageXpress®顯微共聚焦高內(nèi)涵成像系統(tǒng)（ImageXpress® Micro Confocal High-Content Imaging System（Molecular Devices））進行圖像采集，物鏡為20× Plan Apo objective,，激發(fā)/發(fā)射濾光片如下：DAPI 377/447,，FITC 475/536，TRITC 543/593,，Texas Red 560/624,，Cy5 631/692。

5,、用IN CartaTM圖像分析軟件進行圖像分析,。選擇的280個測量值包括跟強度、紋理,、形狀,、空間關(guān)系及共定位評分相關(guān)的參數(shù)。

6,、細胞級數(shù)據(jù)已上傳至StratoMineRTM進行進一步數(shù)據(jù)分析,。簡言之就是實施了質(zhì)量控制、微孔板正規(guī)化,、數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換以及特征標準化,。用主成分分析（principal component analysis，PCA）降低數(shù)據(jù)集的維度,。進一步的下游分析,，例如命中選擇及聚類分析，則基于主成分和推導的表型距離評分,。

結(jié)果

血管生成建模

在我們的模型檢測中,，U2OS細胞用11種化合物處理24小時，之后按照以前發(fā)表的實驗方案處理,。用ImageXpress顯微共聚焦系統(tǒng)進行細胞成像（圖1）,。

圖1. 細胞涂色檢驗。細胞經(jīng)化合物處理,，染色然后成像,。對照孔各個采集通道的成像示例。最后一個圖片展示了肌動蛋白,、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細胞核的復(fù)合圖像,。

特征提取

使用IN Carta軟件，可調(diào)整圖像分析程序以實現(xiàn)細胞及細胞器的可靠檢測（圖2）,。深度學習語義分割模塊（SINAP）可以用來提升挑戰(zhàn)性特征的檢測,。預(yù)訓練的深度學習模型可用來檢測細胞核或細胞,。或者，用戶也可以根據(jù)自己感興趣的特定對象來訓練新的模型,。

圖2. IN Carta軟件中的特征提取,。A）在IN Carta軟件中建立分析實驗方案來分割各個細胞結(jié)構(gòu)。此處我們用內(nèi)置的細胞核模型實現(xiàn)了所有處理的細胞核的有效分割,。其他細胞特征包括細胞質(zhì)區(qū)域,、肌動蛋白絲網(wǎng)絡(luò)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體也得到了分割,。在設(shè)定分析時選擇了跟強度,、紋理、共定位和形狀相關(guān)的測量值,。在實驗方案中我們共選擇了細胞及亞細胞結(jié)構(gòu)的280個測量值,。B）IN Carta軟件中帶有特征掩飾疊加的圖像示例。

數(shù)據(jù)分析工作流程

將IN Carta軟件中獲得的測量值上傳至HC StratoMineR進行進一步數(shù)據(jù)分析（圖3）,。

圖3A-B. 利用HC StratoMineR進行數(shù)據(jù)分析,。A）HC StratoMineR是一個基于網(wǎng)絡(luò)的平臺，能通過典型的工作流程指導用戶進行高內(nèi)涵多參數(shù)數(shù)據(jù)分析,。B）QC步驟的散點圖,。X軸代表了所有樣本，Y軸代表了選中的特征（細胞核區(qū)域）,。

圖3C-D. 利用HC StratoMineR進行數(shù)據(jù)分析,。C）主成分分析（廣義加權(quán)最小二乘法）將數(shù)據(jù)減低至15個成分。對PCA4的特征貢獻以極坐標圖顯示,。D）3D散點圖顯示了數(shù)據(jù)點與3種不同PCA之間的互作,。

表型特征比較-聚類

距離分數(shù)根據(jù)選定的主成分分數(shù)進行計算。這一分數(shù)代表了樣本與陰性對照之間的表型距離,，能用于篩選分析中的命中選擇,。隨后，可基于選中的特征或成分進行分層聚類分析,。

用同一種化合物處理的細胞聚類到一起（圖4A,，簇9,10）。已知具有相似細胞效應(yīng)的化合物也聚類到一起,。肌動蛋白聚合抑制劑細胞松弛素D和拉氏菌素B共同存在于簇6中,。在自噬信號通路中有作用的粉防己堿和氯喹也聚類到一起（圖4B）。

圖4. 聚類分析,。A）樹狀圖代表了分層關(guān)系,。屬于相同簇的孔（編號）用彩條表示。每個孔基于距離分數(shù)的p值展示了出來,。注意,，簇9僅由十字孢堿處理的細胞組成，而簇10僅由依托泊苷處理的細胞組成,。B）屬于某些簇的化合物處理的細胞示例,。簇5由粉防己堿和氯喹處理的細胞組成。兩者處理的孔中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)點都有增加,。簇4由魚藤酮和紫杉醇處理的細胞組成,，這些孔中的部分細胞有起泡出現(xiàn)。表明了細胞毒性作用,。

基于表型特征的劑量-反應(yīng)建模

圖5. 劑量-反應(yīng)曲線,。使用從命中選擇步驟獲得的表型距離分數(shù)繪制IC StratoMineR中每一種化合物劑量反應(yīng)曲線。Y軸代表了表型距離,，X軸代表濃度,。

結(jié)論

我們的結(jié)果表明利用ImageXpress顯微共聚焦系統(tǒng)、IN Carta軟件和StratoMineR實現(xiàn)基于圖像的分析的可行性,。

IN Carta軟件結(jié)合了易用性及更高級的特征分割選項（SINAP）,，可實現(xiàn)細胞特征的可靠分割。

StratoMineR平臺允許非專家用戶根據(jù)直觀的引導式工作流程進行快速的表型數(shù)據(jù)分析,。

參考文獻

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