簡介

使用半固體培養(yǎng)基（軟瓊脂或人工基底膜）中的細胞培養(yǎng)物進行的細胞轉化/致瘤性檢測已經在腫瘤研究中得到很好的運用,。該檢測要求細胞以一種不依賴錨定的方式生長，這是腫瘤細胞的標志,。與 2D 單層培養(yǎng)的貼壁細胞相比,，3D 生長條件被認為可更準確地反映腫瘤細胞的自然環(huán)境，并跨越 2D 培養(yǎng)物和動物研究之間的差距3,，5,。重要的是，3D 檢測比動物的致瘤如小鼠異種移植模型相關性更好,。人們對開發(fā)個體化醫(yī)療方法的興趣日益濃厚,，在這些方法中，對個體患者的腫瘤細胞進行了一組藥物敏感性檢測4,，這導致了對相關性和時效性研究的更高需求,。

由于菌落的主觀定義，3D 檢測以前是勞動密集型的且不一致的,，不適合高通量篩選,。在這項研究中，我們描述了一種與高通量篩選兼容的方法,，其中使用高內涵成像和 3D 分析檢測和定量化合物對半固相培養(yǎng)基中細胞生長的影響,。

適用于篩選的實驗方案 

為了在半固相培養(yǎng)基中制備細胞球培養(yǎng)物，將人結腸癌 HCT116 細胞與在生長培養(yǎng)基中稀釋的 4.25 mg/mL 冷基質膠 （Corning） 溶液預先混合,，并以500細胞/孔,，總體積為25 µL 的密度鋪板至 96 孔半面積板 （Greiner） 中。將板在 37°C 下孵育 30 分鐘以固化凝膠,，然后添加 25 ML 培養(yǎng)基,。在 24-48 小時內，每個孔中均形成細胞球克隆,。

用抗腫瘤化合物處理細胞球培養(yǎng)物 5 天,。將化合物以 2X 濃度在培養(yǎng)基中稀釋，并將 25 uL 的 6 點稀釋系列添加到一式三份孔中,。在第 3 天,，我們通過用 1X 化合物稀釋液交換一半培養(yǎng)基來添加新鮮化合物。在用測試化合物處理結束時,，用兩種染料的混合物對細胞進行染色：最終濃度 1 µM Calcein AM 和 5 µM Hoechst 33342 （Life Technologies）,。以 3X 濃度制備染料溶液,，直接添加到培養(yǎng)基中，無需吹打,，并在成像前孵育 2 小時,。在另一種檢測中，使用 4% 甲醛溶液將細胞固定 1 小時,，每次去除一半體積,，用 PBS 洗滌 3 次。然后用 5 µM Hoechst 33342 和 0.06 µM AlexaFluor-488 Phalloidin （Life Technologies） 對細胞進行染色,。

優(yōu)勢

對細胞球進行高通量篩選,，以實現(xiàn)高效和一致的采集

定量和測量更具生理相關性的模型的特征

使用集成軟件解決方案縮短分析時間

集成共聚焦成像和 3D 分析

使用 ImageXpress Micro Confocal 共聚焦高內涵成像系統(tǒng) （Molecular Devices） 采集圖像，其中 20x Plan Fluor 或 10x Plan Fluor 物鏡（圖 1）,。使用 5-10 µm 間隔的 11-20 個 z 層獲得 100-150 µm 的 z 堆疊范圍（10 倍物鏡）或 2-5 µm（20 倍物鏡）,。每個孔拍攝兩個視野，所有單獨的 z 層以及每個 z 堆疊的 2D 最大投影圖像都被保存用于 3D 分析（圖 2）,。

圖 1：用 Hoechst 和 AF488-phalloidin染色的基質膠細胞球的最大投影圖像,。

圖 2. Matrigel 中細胞球的 Z 平面。 用 Hoechst 和 AF488-Phalloidin 對細胞球進行染色,。指示與孔底的距離,。

使用 MetaXpress 高內涵圖像采集和分析軟件的自定義模塊編輯器中的 3D 分析模塊分析圖像。根據大小和強度定義細胞球和單個細胞,。然后,，細胞球大小和表型的特征是細胞標記的體積、直徑和熒光強度,。使用自定義分析模塊（圖 3）生成多參數(shù)輸出,，每個細胞球的讀數(shù)包括核計數(shù)、大小,、體積,、強度,、每個細胞球的活細胞,、全細胞體積和直徑、細胞球直徑以及細胞標記物（Calcein AM,、Phalloidin 或 Hoechst）的平均強度的測量值,。上述讀數(shù)可按單個對象（細胞球）報告，或按孔平均值報告,。每孔可采集額外的視野以增加評價的細胞數(shù)量,。使用 4 參數(shù)曲線擬合確定 IC50 值（圖 4）。

圖 3. 使用 MetaXpress 自定義模塊編輯器定義細胞球,。（A） 計數(shù)核和 （B） 細胞分類模塊定義了每個目標標記物的細胞球計數(shù)和單個細胞評分,。

•       阿糖胞苷

•       多柔比星

•       順鉑

•       氟腺嘌呤

圖 4. 選定化合物的濃度-反應,。 在 3D 體積內計算 （A） 細胞球/孔數(shù)量、（B） 活細胞/孔數(shù)量和 （C） 活細胞/細胞球總體積的測量值,。

表 1 使用每個孔的細胞球數(shù)量和讀數(shù)測量選定化合物的 IC 值。