簡(jiǎn)介

使用半固體培養(yǎng)基（軟瓊脂或人工基底膜）中的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行的細(xì)胞轉(zhuǎn)化/致瘤性檢測(cè)已經(jīng)在腫瘤研究中得到很好的運(yùn)用,。該檢測(cè)要求細(xì)胞以一種不依賴(lài)錨定的方式生長(zhǎng),，這是腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志。與 2D 單層培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞相比,，3D 生長(zhǎng)條件被認(rèn)為可更準(zhǔn)確地反映腫瘤細(xì)胞的自然環(huán)境,，并跨越 2D 培養(yǎng)物和動(dòng)物研究之間的差距3，5,。重要的是,，3D 檢測(cè)比動(dòng)物的致瘤如小鼠異種移植模型相關(guān)性更好。人們對(duì)開(kāi)發(fā)個(gè)體化醫(yī)療方法的興趣日益濃厚,，在這些方法中,，對(duì)個(gè)體患者的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行了一組藥物敏感性檢測(cè)4，這導(dǎo)致了對(duì)相關(guān)性和時(shí)效性研究的更高需求,。

由于菌落的主觀定義,，3D 檢測(cè)以前是勞動(dòng)密集型的且不一致的，不適合高通量篩選,。在這項(xiàng)研究中,，我們描述了一種與高通量篩選兼容的方法，其中使用高內(nèi)涵成像和 3D 分析檢測(cè)和定量化合物對(duì)半固相培養(yǎng)基中細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,。

適用于篩選的實(shí)驗(yàn)方案 

為了在半固相培養(yǎng)基中制備細(xì)胞球培養(yǎng)物,，將人結(jié)腸癌 HCT116 細(xì)胞與在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中稀釋的 4.25 mg/mL 冷基質(zhì)膠 （Corning） 溶液預(yù)先混合，并以500細(xì)胞/孔,，總體積為25 µL 的密度鋪板至 96 孔半面積板 （Greiner） 中,。將板在 37°C 下孵育 30 分鐘以固化凝膠,，然后添加 25 ML 培養(yǎng)基。在 24-48 小時(shí)內(nèi),，每個(gè)孔中均形成細(xì)胞球克隆,。

用抗腫瘤化合物處理細(xì)胞球培養(yǎng)物 5 天。將化合物以 2X 濃度在培養(yǎng)基中稀釋?zhuān)?/span> 25 uL 的 6 點(diǎn)稀釋系列添加到一式三份孔中,。在第 3 天,，我們通過(guò)用 1X 化合物稀釋液交換一半培養(yǎng)基來(lái)添加新鮮化合物。在用測(cè)試化合物處理結(jié)束時(shí),，用兩種染料的混合物對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色：最終濃度 1 µM Calcein AM 和 5 µM Hoechst 33342 （Life Technologies）,。以 3X 濃度制備染料溶液，直接添加到培養(yǎng)基中,，無(wú)需吹打,，并在成像前孵育 2 小時(shí)。在另一種檢測(cè)中,，使用 4% 甲醛溶液將細(xì)胞固定 1 小時(shí),，每次去除一半體積，用 PBS 洗滌 3 次,。然后用 5 µM Hoechst 33342 和 0.06 µM AlexaFluor-488 Phalloidin （Life Technologies） 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色,。

優(yōu)勢(shì)

對(duì)細(xì)胞球進(jìn)行高通量篩選，以實(shí)現(xiàn)高效和一致的采集

定量和測(cè)量更具生理相關(guān)性的模型的特征

使用集成軟件解決方案縮短分析時(shí)間

集成共聚焦成像和 3D 分析

使用 ImageXpress Micro Confocal 共聚焦高內(nèi)涵成像系統(tǒng) （Molecular Devices） 采集圖像,，其中 20x Plan Fluor 或 10x Plan Fluor 物鏡（圖 1）,。使用 5-10 µm 間隔的 11-20 個(gè) z 層獲得 100-150 µm 的 z 堆疊范圍（10 倍物鏡）或 2-5 µm（20 倍物鏡）。每個(gè)孔拍攝兩個(gè)視野,，所有單獨(dú)的 z 層以及每個(gè) z 堆疊的 2D 最大投影圖像都被保存用于 3D 分析（圖 2）,。

圖 1：用 Hoechst 和 AF488-phalloidin染色的基質(zhì)膠細(xì)胞球的最大投影圖像。

圖 2. Matrigel 中細(xì)胞球的 Z 平面,。 用 Hoechst 和 AF488-Phalloidin 對(duì)細(xì)胞球進(jìn)行染色,。指示與孔底的距離。

使用 MetaXpress 高內(nèi)涵圖像采集和分析軟件的自定義模塊編輯器中的 3D 分析模塊分析圖像,。根據(jù)大小和強(qiáng)度定義細(xì)胞球和單個(gè)細(xì)胞,。然后，細(xì)胞球大小和表型的特征是細(xì)胞標(biāo)記的體積,、直徑和熒光強(qiáng)度,。使用自定義分析模塊（圖 3）生成多參數(shù)輸出，每個(gè)細(xì)胞球的讀數(shù)包括核計(jì)數(shù),、大小,、體積、強(qiáng)度,、每個(gè)細(xì)胞球的活細(xì)胞,、全細(xì)胞體積和直徑,、細(xì)胞球直徑以及細(xì)胞標(biāo)記物（Calcein AM、Phalloidin 或 Hoechst）的平均強(qiáng)度的測(cè)量值,。上述讀數(shù)可按單個(gè)對(duì)象（細(xì)胞球）報(bào)告,，或按孔平均值報(bào)告。每孔可采集額外的視野以增加評(píng)價(jià)的細(xì)胞數(shù)量,。使用 4 參數(shù)曲線(xiàn)擬合確定 IC50 值（圖 4）,。

圖 3. 使用 MetaXpress 自定義模塊編輯器定義細(xì)胞球。（A） 計(jì)數(shù)核和 （B） 細(xì)胞分類(lèi)模塊定義了每個(gè)目標(biāo)標(biāo)記物的細(xì)胞球計(jì)數(shù)和單個(gè)細(xì)胞評(píng)分,。

•       阿糖胞苷

•       多柔比星

•       順鉑

•       氟腺嘌呤

圖 4. 選定化合物的濃度-反應(yīng),。 在 3D 體積內(nèi)計(jì)算 （A） 細(xì)胞球/孔數(shù)量、（B） 活細(xì)胞/孔數(shù)量和 （C） 活細(xì)胞/細(xì)胞球總體積的測(cè)量值,。

表 1 使用每個(gè)孔的細(xì)胞球數(shù)量和讀數(shù)測(cè)量選定化合物的 IC 值。