自噬是干預治療的一個潛在領域

自噬是隔離和降解那些被識別為錯誤或者僅僅是不再被細胞需要的蛋白和細胞器的一個胞內(nèi)分解代謝過程,。自噬通過實施清除入侵微生物,、錯誤折疊蛋白及退化的細胞器等“管家"功能來支持正常的細胞進程,。自噬對于維持細胞穩(wěn)態(tài)很關(guān)鍵,。除了作為細胞物質(zhì)周轉(zhuǎn)機制,，自噬還能通過調(diào)節(jié)能量消耗速率及物質(zhì)再利用等過程來支持生命體應對饑餓等挑戰(zhàn),。

自噬在癌癥、傳染性疾病,、糖尿病,、神經(jīng)退行性疾病及其他疾病中發(fā)揮著有益或有害的作用。自噬在神經(jīng)細胞研究方面令人特別感興趣,，因為它幫忙維持著蛋白結(jié)構(gòu)使其能在很長的軸突距離上發(fā)揮作用,。與其他組織細胞不同，神經(jīng)元的胞質(zhì)內(nèi)容物并不會被有絲分裂常規(guī)稀釋,。在阿爾茨海默病、帕金森病及其他神經(jīng)紊亂中發(fā)現(xiàn)自噬發(fā)生改變且細胞毒素積累,。這些觀察結(jié)果導致了關(guān)于自噬作為干預治療潛在領域各種機制的思考,。定量實驗變量對這一過程的影響是研究的基本要素，可能導致開發(fā)針對自噬的安全有效的治療方法,。

益處

生成未標記的神經(jīng)突起的準確分割

更深入的了解神經(jīng)退行性疾病的機制

更精確地區(qū)分相似的亞細胞結(jié)構(gòu)

在單個孔中測量多種生物學以生成豐富的數(shù)據(jù)

材料

CYTO-ID® 自噬試劑（恩佐生命科學）

熒光溶酶體染料

iCell® 人類誘導多能干細胞衍生神經(jīng)元（細胞動力學國際）

大鼠PC-12細胞（ATCC, cat no. CRL-1721）

ImageXpress® 顯微高內(nèi)涵成像系統(tǒng)（美谷分子儀器）

MetaXpress® 高內(nèi)涵圖像獲取及分析軟件（美谷分子儀器）

通過熒光成像觀察自噬

即使在異質(zhì)細胞群中,，也可以使用現(xiàn)成的試劑對自噬進行可視化和表征。

CYTO-ID自噬試劑選擇性地對吞噬團,、自噬體和自溶酶體的膜進行染色,。它還被證明與自噬體蛋白LC3-II共定位。它具有 495/519 nm 的熒光激發(fā)/發(fā)射曲線，可與標準 FITC 濾光片組一起使用,。借助溶酶體特異性熒光可視化,，可以檢測與溶酶體的破壞性自噬體融合（圖1）。在下面的示例中,，使用激發(fā)/發(fā)射波長為 647/668 nm 的熒光溶酶體染料來表征溶酶體活性,。標準 Cy5 濾光片組可用于檢測深紅色溶酶體染料的發(fā)射。

圖1. 當內(nèi)部或外部信號促進吞噬團（球形雙膜隔離結(jié)構(gòu)）的形成時,，自噬過程就開始了,。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3α（LC3）刺激吞噬團的伸長，其開始吞噬細胞質(zhì)靶標,。在由自噬相關(guān)（ATG）蛋白介導的過程中,，吞噬細胞在靶標周圍關(guān)閉，成為自噬體,。然后,，自噬體與溶酶體融合，使其內(nèi)容物和自身膜被水解酶降解1,。

能夠同時分析表型變化

活細胞中自噬體的CYTO-ID Green染色和溶酶體染色水平提供了有關(guān)化合物刺激或抑制自噬途徑的機制的信息,。這是使用 ImageXpress 顯微系統(tǒng)完成的，這是一種高內(nèi)涵篩選系統(tǒng),，用于對固定或活細胞,、組織和小生物體進行寬場熒光或明場成像（圖 2）。

MetaXpress軟件使用預配置的應用程序或定制模塊分析圖像,，以表征表型變化并產(chǎn)生特定的輸出,。定制模塊能夠同時檢測、測量和對多個染色小體（如細胞核,、自噬體和溶酶體）進行面積求和,。測量值隨時間推移或?qū)φ諏嶒灄l件（例如一系列藥物化合物濃度）繪制。

圖2. 使用自動成像簡化定量工作流程,。簡單和自動化的工作流程適用于高通量篩選,，即使對于從鋪板到最終結(jié)果可能需要數(shù)天的實驗，也只需要最少的手動操作時間,。

自噬體數(shù)量增加提示細胞窘迫

iCell人誘導多能干細胞（iPSC）衍生神經(jīng)元和大鼠PC-12細胞用于證明在384孔微孔板的每個孔中測試多個細胞反應的效用,。

人類神經(jīng)元

神經(jīng)元以5000個細胞/孔接種，并按照制造商的建議進行生長,。5天后,，用在維持培養(yǎng)基中制備的一系列稀釋化合物處理細胞?；衔锓跤?/span>24小時后,，對溶酶體、細胞核和自噬體進行染色，并使用ImageXpress顯微系統(tǒng)將腔室加熱至37°C對活細胞進行成像,。使用60× Plan Fluor或40× Plan Apo物鏡從每孔2-4個位點獲取圖像（圖3A）,。使用MetaXpress軟件完成圖像分析，以量化暴露于一系列濃度的實驗化合物的影響（圖3B）,。雖然示例圖像出于說明目的以60倍放大倍數(shù)顯示細胞,，但圖3-6中的圖表中的數(shù)據(jù)來自相同的實驗，但使用40倍放大倍數(shù),。較低的放大倍率可生成足夠質(zhì)量的圖像來測量細胞內(nèi)囊泡,，同時提供在每個視野內(nèi)捕獲更多細胞的好處。

大鼠PC-12細胞

將PC-12細胞以2000個細胞/孔接種并培養(yǎng)過夜,，然后用在培養(yǎng)基中制備的系列稀釋化合物進行處理,。24小時后，對溶酶體,、細胞核和自噬體進行染色,，并在37°C下對活細胞進行成像。 在40×放大倍率下從每孔2-4個位點獲取圖像,。使用MetaXpress軟件完成圖像分析,，以定量暴露于一定濃度范圍內(nèi)的實驗化合物的影響（圖4）。

溶酶體反應提示自噬途徑中斷

人類神經(jīng)元

溶酶體的測定在與前面描述的相同的孔中進行,，并具有相同的程序,，但添加了溶酶體染料（圖5）。

大鼠PC-12細胞

在PC-12細胞中進行相同的測定以測量多種毒性事件,。測量幾個參數(shù)以確定對細胞內(nèi)溶酶體的影響（圖6）,。

圖3. 定量暴露于實驗化合物對人類神經(jīng)元的影響。（A）暴露于三種不同濃度的三種不同化合物后人類神經(jīng)元的代表性60倍放大圖像,。自噬體（綠色）以劑量依賴性方式對細胞治療作出反應,。（B）氯喹、魚藤酮和維拉帕米對人神經(jīng)元聚集自噬體區(qū)域的劑量反應作用,。自噬體可能被化合物暴露抑制或刺激,。

圖4. 暴露于實驗化合物對大鼠PC-12細胞的影響的量化。（A）暴露于三種不同濃度三種不同化合物后的大鼠PC-12細胞的代表性60倍放大圖像,。自噬體(綠色)可以清晰地可視化和測量,。（B）氯喹、魚藤酮和維拉帕米對大鼠PC-12細胞中自噬體總面積的劑量反應效應,。自噬體可能受到化合物暴露的抑制或刺激。

圖5. 人類神經(jīng)元中溶酶體反應的量化,。（A）暴露于三種不同濃度的三種不同化合物后iPSC衍生神經(jīng)元的代表性圖像,。溶酶體（紅色）可以可視化和測量以檢測反應。（B）氯喹、魚藤酮和維拉帕米對神經(jīng)元中總?cè)苊阁w面積的劑量反應效應,，這是自噬的第二種測量,。溶酶體測量可以表明在兩個囊泡融合的最后一步自噬體途徑的破壞。

圖6. 大鼠PC-12細胞中溶酶體反應的定量,。（A）暴露于三種不同濃度的三種不同化合物后大鼠PC-12細胞的代表性圖像,。上述圖像是使用60× PF物鏡采集的。溶酶體以紅色顯示,。定量細胞內(nèi)溶酶體的減少或增加為化合物的毒性機制提供了線索,。（B）氯喹、魚藤酮和維拉帕米對大鼠PC-12細胞中聚集溶酶體區(qū)域的劑量反應效應,，這是自噬的第二種測量,。溶酶體可能受到化合物暴露的抑制或刺激。

圖7. 使用自定義模塊的神經(jīng)元分割,。（左）透射光（灰色）,、Hoechst染色的細胞核（藍色）和CYTO-ID染色的自噬體（綠色）的放大40倍放大圖像的疊加。（右）分割掩碼,，其中細胞體和從透射光圖像中識別為藍綠色的副產(chǎn)物,，健康細胞核被識別為黃色，凋亡細胞核被識別為粉紅色,，自噬體被寶藍色識別,。即使遠離細胞體（如箭頭所指），也可以對自噬體進行計數(shù),。

使用透射光圖像生成準確的神經(jīng)元分割

檢測遠離細胞體的神經(jīng)突生長物中的自噬體可能具有挑戰(zhàn)性,。獲得未染色細胞體的明場圖像有助于分段具有長過程的細胞。為了僅精確量化與神經(jīng)元相關(guān)的染色細胞器構(gòu)建了一個定制模塊,。這確保了僅檢測感興趣的細胞對象,，而不是染色的人工制品或碎片（圖7）。

AcuityXpressTM分析軟件創(chuàng)建了自定義模塊分析生成的讀數(shù)劑量反應曲線（圖8）,。維拉帕米和氯喹均觀察到明顯的自噬體形成劑量依賴性反應,。圖9列出了自噬體和溶酶體形成所觀察到的化合物抑制或刺激自噬的EC50值。

圖8. 維拉帕米和氯喹自噬體形成的劑量反應曲線,。使用圖7中定義的自定義模塊分析圖像,，生成的測量值用于在AcuityXpress分析軟件中繪制曲線。

圖9. 被測化合物的EC50值,。通過將劑量反應曲線擬合到非線性模型來計算抑制或刺激自噬的化合物的EC50值,。不同的細胞類型對藥物暴露表現(xiàn)出不同的敏感性并不意外。

結(jié)論

我們證明了評估特定神經(jīng)元細胞培養(yǎng)物中相對于實驗條件的自噬的能力,。這為研究人員提供了檢查實驗化合物對神經(jīng)元自噬的劑量反應影響或篩選可能影響自噬的化合物庫的機會,，從而篩選與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的神經(jīng)元生理機制,。 

ImageXpress顯微系統(tǒng)提供了一系列功能，包括寬場高分辨率明場和多波長熒光顯微鏡,，能夠捕獲在384孔微孔板中培養(yǎng)的人和大鼠神經(jīng)元細胞的圖像,。MetaXpress軟件能夠分析這些圖像，并繪制實驗條件與自噬發(fā)生之間的關(guān)系,，通過測量的自噬體,，溶酶體和其他可視化細胞成分的聚集面積進行量化。

參考文獻

1. Mizushima, Yoshimori and Levine (2010) Methods in Mammalian Autophagy Research. Cell 140:313-326.

2. Jin H. Son, et. al. (2012) Neuronal autophagy and neurodegenerative diseases. Experimental and Molecular Medicine 44, 2:89-98.