簡介

大多數(shù)體外細(xì)胞培養(yǎng)工作是在二維 (2D) 模式下進(jìn)行的,，這樣細(xì)胞可以在平面上生長。然而，在 2D 中培養(yǎng)細(xì)胞以篩選藥物可提供體內(nèi)發(fā)生情況的圖像有限，因為它無法捕獲來自細(xì)胞外基質(zhì) （ECM） 的信號如何影響細(xì)胞對不同化合物的反應(yīng),。相反，腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞球可以在微孔板中培養(yǎng),，并在三維 （3D） 基質(zhì)中成像,，以便在更接近模擬體內(nèi)腫瘤微環(huán)境的模型中篩選藥物。

在這里,，我們將新型光交聯(lián) 3D 細(xì)胞培養(yǎng)平臺,、Symphony® 儀器和 VersaGel® ECM 水凝膠與 ImageXpress® Micro Confocal 共聚焦高內(nèi)涵成像系統(tǒng)配對，以展示適用于高通量篩選的 3D 檢測,。VersaGel 是一種可光交聯(lián)的 ECM 水凝膠,，用于 3D 體外和離體測定。這種可調(diào)諧的 ECM 水凝膠可概括人體生理學(xué)并支持多種細(xì)胞類型,。腫瘤細(xì)胞懸液或細(xì)胞球可包封在 VersaGel 中。一旦細(xì)胞模型建立,，可添加化合物,，隨后進(jìn)行細(xì)胞染色，隨后對培養(yǎng)物進(jìn)行成像,。

為了進(jìn)一步提高通量,，MetaXpress® 高內(nèi)涵圖像采集和分析軟件允許在僅觀察到 1-4 個細(xì)胞球/孔的實驗中使用 QuickID。使用 QuickID,，可在低放大倍率下快速掃描整個板,，然后僅在更高放大倍率和多個 z 平面下對包含細(xì)胞球的孔或視野進(jìn)行重新成像。我們展示

經(jīng)化療藥物處理的三種不同 VersaGel 硬度中不同腫瘤細(xì)胞系的優(yōu)化細(xì)胞球生長的結(jié)果,，以說明 Symphony 和 VersaGel 如何與 ImageXpress Micro Confocal 系統(tǒng)搭配使用是一個簡單的工作流程,，可為藥物篩選提供強(qiáng)大的解決方案（圖 1）。

圖 1：Symphony 和 VersaGel 3D 培養(yǎng)系統(tǒng)隨后使用 ImageXpress Micro Confocal 共聚焦系統(tǒng)成像,，是一種生理學(xué)相關(guān)的方法,，適用于高通量藥物篩選。

優(yōu)勢

使用 Symphony 和 VersaGel 3D 平臺篩選 3D 細(xì)胞球中的藥物

使用自動 QuickID 靶向成像將數(shù)據(jù)采集速度

圖像生成量比標(biāo)準(zhǔn)采集少 20X

渲染 3D 對象或 2D 投影以進(jìn)行分割

Materials

•       已證實的腫瘤細(xì)胞系 - U2OS, MCF-7, HCT-116

•       玻璃底,，96 孔微孔板（Greiner）

•       EarlyTox Caspase-3/7-D NucView 488 檢測試劑盒（Molecular Devices,，PN R8348）

•       EarlyTox 活細(xì)胞/死細(xì)胞檢測（Molecular Devices，PN R8340）

•       VersaGel ECM 水凝膠 （Cypre,， Inc.）

•       Symphony 儀器 （Cypre,， Inc.）

•       ImageXpress Micro Confocal 共聚焦高內(nèi)涵成像系統(tǒng)與 MetaXpress 高內(nèi)涵圖像采集和分析軟件 （Molecular Devices）

3D VersaGel 細(xì)胞球生長和成像方法 

Symphony 和 VersaGel 3D 培養(yǎng)平臺使用一種簡單的技術(shù)，其中液體 VersaGel 最初以 1：1 的體積比例與培養(yǎng)基中的細(xì)胞或細(xì)胞球混合。接下來,，VersaGel/細(xì)胞球混合物被 Symphony 交聯(lián),，使整個板暴露于低強(qiáng)度藍(lán)光下 60 秒，以使孔內(nèi)的凝膠聚合,。然后可以使用 ImageXpress Micro Confocal 系統(tǒng)對細(xì)胞球進(jìn)行成像,。由于 VersaGel 是微孔的，細(xì)胞可以用小分子化合物或抗體處理,，并在包封在基質(zhì)中后染色并固定甲醛,。基質(zhì)保持附著在平板上,，可在 4°C 下儲存,，而不影響固定后的結(jié)構(gòu)。

使用 QuickID 靶向成像提高成像效率

QuickID 通過靶向 96 孔板中成像的細(xì)胞球簡化成像,。首先使用 2X 物鏡在一個視野中捕獲整個孔,。識別目標(biāo)對象，并使用其 X 和 Y 坐標(biāo)自動獲得多個 z 平面上三個波長的更高放大倍數(shù)的圖像,。該過程比高倍放大下的手動細(xì)胞球成像快 10X,，產(chǎn)生的高分辨率圖像需要存儲的時間減少了 20X（圖 2）。

圖 2. QuickID 用于簡化細(xì)胞球圖像的采集,。在低放大倍率下采集的用于在一個視野中查看整個孔的圖像被用于識別對象,，以便使用跨多個 z 平面的三個波長在更高的放大倍率下自動重新成像。

優(yōu)化生長和染色條件

為了優(yōu)化源自 MCF-7 乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞球的條件,，首先在超低附著微孔板中培養(yǎng)單個細(xì)胞球,，方法是在圓底 96 孔板中接種 1，500 個細(xì)胞/孔,，并培養(yǎng) 3-5 天,。然后將培養(yǎng)基中的細(xì)胞球與三種不同的 VersaGel 制劑以 1：1 的體積比組合，并將 50 uL/孔轉(zhuǎn)移至玻璃底 96 孔微孔板,。使用 Symphony 儀器使凝膠聚合,，并且在用 Hoechst 和 Phalloidin-AlexaFluor 546 固定和染色之前，使囊封的細(xì)胞球再生長三天,。MCF-7 細(xì)胞球的共聚焦圖像顯示,，它們在堅硬的 VersaGel 中通常保持更緊湊，并且在軟制劑中生長的球形更少（圖 3）,。

圖 3. MCF-7 細(xì)胞球在三種 VersaGel 硬度下培養(yǎng),。 細(xì)胞球形狀和大小略有不同，但選擇標(biāo)準(zhǔn)凝膠硬度進(jìn)行進(jìn)一步實驗,。

使用 EarlyTox 檢測試劑盒檢測化合物對細(xì)胞球的影響

EarlyTox 活細(xì)胞/死細(xì)胞測定用于確定 U2OS 骨癌細(xì)胞球的活性,。在 VersaGel 中交聯(lián)活細(xì)胞,、預(yù)形成的細(xì)胞球后，它們再生長兩天,，然后用化合物處理 48 小時,。用通常用于 2D 細(xì)胞培養(yǎng)的兩倍染料濃度對細(xì)胞球進(jìn)行染色，并孵育兩倍長的時間,。使用 QuickID 識別細(xì)胞球,，并測量活染（綠色）與死染（紅色）相比的存在（圖 4A）。結(jié)果（圖 4B）確認(rèn)使用 Symphony 和 VersaGel 平臺與預(yù)成形細(xì)胞球兼容 EarlyToxLive/Dead 檢測,。

圖 4. EarlyTox 活細(xì)胞/死細(xì)胞檢測與 VersaGel 中的細(xì)胞球兼容,。A） 用三種不同的化合物處理預(yù)形成的 U2OS 細(xì)胞球 48 小時。B） 存在活染（綠色）和死染（紅色）時測得的毒性,。腫瘤細(xì)胞球?qū)γ糠N藥物化合物的反應(yīng)與預(yù)期一致,。

然后，我們使用 EarlyTox Caspase 3/7 檢測與在標(biāo)準(zhǔn) VersaGel 中培養(yǎng)的預(yù)成型 HCT-116 結(jié)腸癌細(xì)胞球,，如前所述,。用三種不同的化合物處理細(xì)胞球 48 小時，并使用 QuickID 識別和測定凋亡細(xì)胞核的存在（綠色）
（圖 5）,。分析結(jié)果顯示對化合物的預(yù)期反應(yīng),，證實了 EarlyToxCaspase 3/7 NucView 488 檢測與 Symphony 和 VersaGel 平臺的兼容性。

圖 5. EarlyTox 凋亡檢測與 VersaGel 兼容,。 用三種不同的化合物處理預(yù)形成的 HCT-116 細(xì)胞球 48 小時,，并通過凋亡核（綠色）的存在來測定細(xì)胞毒性。

2D 投影分析得出的結(jié)論與 3D 分析相同
MetaXpress 軟件用于比較 2D 和 3D 分析之間 HCT-116 細(xì)胞球中的凋亡,。將細(xì)胞球懸浮在 VersaGel 中，并采集多個 Z 平面以收集跨越細(xì)胞球深度的圖像,。所有圖像都被保存以構(gòu)建 3D 對象,，并且還用于創(chuàng)建單個 2D 最佳對焦投影（圖 6A）。

使用EarlyTox Caspase 3/7 NucView 488 檢測法測定細(xì)胞凋亡,，并將 2D 投影分析與 3D 對象分析進(jìn)行比較,。圖形分析表明，使用 2D 和 3D 分析,，依托泊苷處理可增加 HCT-116 細(xì)胞的凋亡（圖 6B）,。

圖 6. 2D 和 3D 分析的比較。左圖是針對凋亡標(biāo)記（綠色）和細(xì)胞核（藍(lán)色）染色的最佳聚焦圖像的疊加圖,。中心圖像是使用*家藍(lán)分割的綠色凋亡細(xì)胞分析 2D 圖像時產(chǎn)生的分割掩膜,。右圖是 3D 對象的分割掩膜，Hoechst 細(xì)胞核呈單色偽彩,，NucView 488 陽性細(xì)胞呈綠色,。B. NucView 488 強(qiáng)度的測定表明，經(jīng)依托泊苷處理的細(xì)胞凋亡增加。3D 分析顯示,，使用 2D 投影分析時,，經(jīng)處理細(xì)胞中的細(xì)胞球體積減少并不明顯。

結(jié)論

該平臺用途廣泛,，是腫瘤腫瘤學(xué)研究的理想選擇,。單個或大體積預(yù)形成的細(xì)胞球可轉(zhuǎn)移至 VersaGel 中，細(xì)胞也可直接在微孔板的 VersaGel 中培養(yǎng),。VersaGel 剛度可進(jìn)行調(diào)整,，以實現(xiàn)最佳細(xì)胞球培養(yǎng)。

QuickID 簡化了該過程,，因此圖像的采集時間比標(biāo)準(zhǔn)成像少得多,，生成的圖像也少得多，從而減少了存儲需求,。此外,，MetaXpress 軟件還簡化了 3D 細(xì)胞分析工作流程，能夠覆蓋細(xì)胞圖像,、構(gòu)建 3D 對象并將圖像折疊成單個 2D 投影進(jìn)行分析,，然后分割陽性細(xì)胞。

該實驗表明,，將 Symphony 和 Versagel 3D 檢測與 ImageXpress Micro Confocal 共聚焦系統(tǒng)配對是一種多功能,、強(qiáng)大的解決方案，可將藥物篩選提升到一個新的水平,。