蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒實(shí)驗(yàn)流程：
1.需要用戶自己準(zhǔn)備的試劑
a.固定液：4%多聚甲醛/通用型組織固定液(abs9179；
b.分化液：5%的乙酸溶液或0.5%的鹽酸乙醇,；
c.如果需要脫水,、透明和封片處理，還需自備二甲苯,，和封片劑(如中性樹膠(鏡檢用封片劑)abs9177）,，及80%乙醇、90%乙醇,、無(wú)水乙醇,；
d.70%乙醇。
2.樣品處理
a.對(duì)于石蠟切片：
二甲苯中脫蠟5-10分鐘,；
換用新鮮的二甲苯,，再脫蠟5-10分鐘；
無(wú)水乙醇5分鐘,；
90%乙醇2分鐘,；
80%乙醇2分鐘；
70%乙醇2分鐘,；
蒸餾水2分鐘,。
b.對(duì)于冰凍切片：
固定液固定10分鐘以上；
蒸餾水2分鐘,。
c.對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞：
固定液固定10分鐘以上；
蒸餾水洗滌2分鐘,；
換用新鮮的蒸餾水,，再洗滌2分鐘。
3.蘇木素：水化后,，組織切片用蘇木素染色 1~3min,，可根據(jù)染色結(jié)果和要求調(diào)整染色時(shí)間。 蘇木素是一種基本染料,，可以對(duì)細(xì)胞的酸性成分進(jìn)行染色,，包括核酸、粘多糖,、酸性糖蛋白,， 將他們?nèi)境伤{(lán)-紫色。 注意：沒有蘇木素,，伊紅會(huì)將組織染成亮粉紅色,；顯而易見的是缺乏細(xì)胞核。組織結(jié)構(gòu)很難 區(qū)分，細(xì)胞內(nèi)成分幾乎都不存在,，難以辨別,。
4.水洗：蘇木素染色后，用水洗組織是非常重要的,。這一步以及隨后的水洗,，可將多余的 染料，媒染劑等去除,。適當(dāng)?shù)钠纯梢匀コ砻娼饘俟鉂?，金屬光澤可阻止蘇木素的染色。 注意：跳過(guò)此步,，將產(chǎn)生不好的結(jié)果,，例如沉淀的形成，染液的稀釋,，表面金屬光澤的存在,。
5.酸酒精：酸酒精分色劑 3~5sec。在蘇木素染色方法中,，組織切片有意過(guò)度染色,，酸酒精 將去除多余的染料以及玻片上的背景染色。 注意：如果沒有此步驟,，組織切片將變?yōu)榘底仙?。嗜酸結(jié)構(gòu)，例如,，膠原,，將不會(huì)呈現(xiàn)明亮 的粉紅色。組織結(jié)構(gòu)之間將很難區(qū)分,。很難對(duì)切片做出正確的判斷,。 分色過(guò)度可能是由于： 1)酸濃度過(guò)高； 2)脫色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)等,。 分色不足是由于： 1)酸濃度過(guò)低,； 2)脫色時(shí)間不足； 3)在切片上有多余的蛋白或者明膠等,。
6.水洗：水洗 30sec,，終止酸酒精反應(yīng)，進(jìn)一步阻止酸酒精從組織切片上將大量蘇木素去除,。 注意：如果切片沒有經(jīng)過(guò)漂洗,，酸酒精可以過(guò)度脫色。如果不去除脫色劑,，酸酒精將持續(xù)從 組織切片上去除蘇木素,。
7.自來(lái)水沖洗或用藍(lán)化液藍(lán)化：自來(lái)水沖洗 3~5min,，可起到發(fā)藍(lán)處理，將紫紅色的蘇木素 轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)紫色,。通常,，發(fā)藍(lán)試劑是 pH 依賴性的，由堿性溶液構(gòu)成,。因此,，如果自來(lái)水作為 發(fā)藍(lán)試劑，pH 值的每天監(jiān)控是非常重要的,，因?yàn)樽詠?lái)水的 pH 值可能每天都會(huì)波動(dòng),。 或用藍(lán)化液藍(lán)化，30sec~1min,；流動(dòng)的自來(lái)水沖洗 5min,； 注意：跳過(guò)發(fā)藍(lán)試劑步驟，將會(huì)導(dǎo)致蘇木素染液的顏色發(fā)生微妙的變化,，難以區(qū)分,。代替深 藍(lán)色，細(xì)胞核將呈現(xiàn)紫色,，有時(shí)甚至是紅色,。細(xì)胞核不可過(guò)度藍(lán)染。如果組織染色過(guò)藍(lán),，一 般是在組織切片上蘇木素過(guò)多所致,。
8.水洗：為伊紅復(fù)染做準(zhǔn)備，通過(guò)水洗 30sec,，將多余的發(fā)藍(lán)試劑去除,。因?yàn)樵趬A性環(huán)境下， 伊紅無(wú)法染色,，水洗去除發(fā)藍(lán)試劑將允許伊紅保持其酸性 pH 值,，使伊紅得以均勻復(fù)染。 注意：發(fā)藍(lán)試劑之后,，如果沒有水洗,，組織切片無(wú)法正確使用伊紅染色,。因此,，酸性結(jié)構(gòu)將 被染為蒼白色并且不均勻，進(jìn)而導(dǎo)致錯(cuò)誤的判斷,。
9.伊紅：為了正確區(qū)分胞內(nèi)結(jié)構(gòu),，伊紅是出色的蘇木素復(fù)染劑。伊紅復(fù)染 30~60sec,，可根 據(jù)染色結(jié)果和要求調(diào)整染色時(shí)間,。伊紅是酸性染料，可染細(xì)胞質(zhì)，尤其是線粒體,、分泌顆粒 和膠原,。它可以區(qū)分細(xì)胞內(nèi)不同的細(xì)胞器以及不同的結(jié)締組織。 注意：使用伊紅復(fù)染組織切片的失敗,，將導(dǎo)致組織切片的低分化,。 染色較弱是由于： 1）組織切片過(guò)薄,； 2）染色時(shí)間不足,； 3）隨后 95%酒精分化過(guò)度。 染色過(guò)度是由于： 1）染液濃度較高（可能是由于過(guò)度蒸發(fā)）,； 2）組織切片過(guò)厚,； 3）染色時(shí) 間過(guò)長(zhǎng)； 4）隨后 95%酒精分化不足,。 伊紅染色未分化（一種顏色）是由于： 1）固定不*,； 2）過(guò)度染色，a）染色時(shí)間過(guò)長(zhǎng),；b）染液濃度過(guò)高,。
10.95%乙醇：95%乙醇處理 2 s~1 min，根據(jù)染色結(jié)果和要求調(diào)整,；伊紅分化將產(chǎn)生不同的 粉色,。 注意：如果 95%乙醇被稀釋（例如，從前一步染色中攜帶了伊紅）,，分化的效果較差,。
11.100%乙醇：通過(guò) 100%乙醇使組織切片脫色。100%乙醇處理 1 min,；再用新的 100%乙醇 處理 1 min,。 注意：這一步很難引起注意，若無(wú) 95%乙醇,，難以區(qū)分酸性結(jié)構(gòu),，組織切片成為粉色。若 無(wú) 100%乙醇脫水,，組織切片不能*脫水,，導(dǎo)致在蓋片下形成水珠。這些水珠可與下一步 的二甲苯結(jié)合而形成白色混濁物,，這將影響組織切片的質(zhì)量,。
12.二甲苯：二甲苯處理 5min。在充分脫水后,，二甲苯可將組織切片上的酒精去除,。去除酒 精后,，在載玻片上加蓋玻片時(shí)，二甲苯也可作為包埋劑確?？扇芙?。由于有潛在的毒性，二 甲苯替代品,，例如環(huán)烷烴也可使用,。替代品可提供相同的組織染色質(zhì)量，并且他們 使用更安全,，操作更簡(jiǎn)單,。 注意：當(dāng)跳過(guò)此步驟時(shí)，不使用二甲苯透明,，酒精將會(huì)保存于組織切片上,，導(dǎo)致伊紅從切片 上流出。
13. 封片：中性樹膠封片,，自然風(fēng)干或烤干,，顯微鏡觀察。
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