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脂質(zhì)是一類廣泛存在于生物體中的有機分子,，它們在細胞的結(jié)構(gòu)和功能中扮演著重要角色,。脂滴和膽固醇是脂質(zhì)的不同形式，它們在結(jié)構(gòu)和功能上有所不同,。脂滴是中性脂的主要貯存場所,，包括脂酰甘油和酯化膽固醇。在病理情況下,，如器官發(fā)生脂肪變性,，細胞內(nèi)可能出現(xiàn)脂滴增多，通過脂肪染色能將這些脂滴清晰的顯現(xiàn)出來,。膽固醇是真核細胞細胞膜的重要成分,，能夠維持膜結(jié)構(gòu)完整性,，調(diào)節(jié)膜流動性，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo),，在動脈硬化,、Ｃ型尼曼匹克病(Niemann-Pick disease type C, NPC)、阿爾茨海默病等疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用,。

脂滴和膽固醇的染色是病理學(xué)和細胞生物學(xué)研究中的重要技術(shù),，用于觀察和量化細胞內(nèi)脂質(zhì)的積累。目前,，脂滴染色使用zui廣泛的染料包括油紅O(Oil Red O),、尼羅紅(Nile Red)、蘇丹染料(Sudan Dyes)等,。膽固醇染色使用最多的染料是菲律平(Filipin III),，Filipin已被廣泛應(yīng)用30余年。它可用于標(biāo)記生物膜結(jié)構(gòu)上及非細胞結(jié)構(gòu)內(nèi)的自由膽固醇,，也能配合應(yīng)用膽固醇酯化酶,，使膽固醇酯水解成自由膽固醇而間接顯色。

接下來,，小愛就給大家詳細介紹脂滴和膽固醇的染色方法,。

一、脂滴染色

1,、組織切片脂滴油紅O(abs42024259)染色

1）實驗原理

油紅O屬于偶氮染料,，是很強的脂溶劑和染脂劑，與甘油三酯結(jié)合呈小脂滴狀,。脂溶性染料能溶于組織和細胞中的脂類,，它在脂類中的溶解度比在溶劑中大。當(dāng)組織切片置入染液時,，染料則離開染液而溶于組織內(nèi)的脂質(zhì)（如脂滴）中,，使組織內(nèi)的脂滴呈橘紅色。

2）染色步驟^[1]

① 油紅O染色液配制：

a.母液準(zhǔn)備：稱取1g油紅O,，加入100mL異內(nèi)醇配置成儲存液,，棕色瓶4℃密封保存。

b.工作液準(zhǔn)備：使用前加雙蒸水稀釋至60%,，濾紙過濾后使用,。

② 用冰凍切片機切取5μm厚的肝組織切片；

③ 用95%乙醇固定,，蒸餾水清洗1min,，60%異丙醇浸泡30min；

④ 再用60%油紅O染色溶液處理10min和15min，蒸餾水沖洗1min,；

⑤ 蘇木素復(fù)染,，用自來水清洗1~3min，光鏡下觀察肝細胞脂質(zhì)沉積情況,。

3）肝組織油紅O染色結(jié)果圖：

（注：圖片來源于文獻[1]）

2,、細胞脂滴尼羅紅(abs9114)染色（以下染色方法僅供參考）

1）實驗原理

尼羅紅是一種親脂性熒光染色劑，它是一類環(huán)境敏感性熒光染料,，能夠在富含脂質(zhì)的環(huán)境中產(chǎn)生強烈的熒光,，而在水性介質(zhì)中的熒光強度極小，這種特性使得它成為了一款極重要檢測細胞內(nèi)脂滴的熒光指示劑,，可以通過熒光顯微鏡和流式細胞檢測結(jié)果,。

2）染色步驟

① 尼羅紅染色液配制：

a.母液準(zhǔn)備：取適量的尼羅紅（Mw：318.37g/mol）用無水DMSO充分溶解制備1mM儲存液，按照單次用量分裝凍存,，避免反復(fù)凍融,，避光保存。

b.工作液準(zhǔn)備：用HHBS或生理緩沖液(pH 7.0)將母液按1:1000稀釋為1×尼羅紅工作液,，漩渦混勻,。

【注意】：

尼羅紅的實際染色濃度請參考文獻或?qū)嶒炇殷w系來調(diào)整。以上只做參考,。

② 用檢測化合物處理細胞一段時間,；

③ 離心并調(diào)整細胞濃度為1-5×10⁵cell/管,；

④ 用500µL尼羅紅工作液重懸細胞,；

⑤ 室溫或37oC避光孵育5-10min；

⑥ 吸掉染色工作液,，用HHBS或適當(dāng)緩沖液清洗細胞,；

⑦ 用500µL預(yù)熱的HHBS或培養(yǎng)基重懸細胞，使細胞密度為1-5×10⁵cell/管,；

⑧ 熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測熒光信號,，Ex/Em=552/636nm。

【注意】：

① 對于貼壁細胞,，可用HHBS或適當(dāng)緩沖液清洗細胞,，然后直接加入尼羅紅工作液孵育；

② 細胞也可預(yù)固定,，然后用尼羅紅工作液染色,。

二、膽固醇染色

細胞膽固醇菲律平(Filipin III, abs42018484)染色

1）實驗原理

菲律平的主要成分是Filipin III,，它可以特異性地與游離膽固醇相互作用,，而不與酯化的膽固醇結(jié)合。這種特異性結(jié)合是由于菲律平分子結(jié)構(gòu)中包含多個共軛雙鍵,，使其能夠與膽固醇分子的疏水部分形成復(fù)合物,。當(dāng)Filipin III與游離膽固醇結(jié)合后,，其激發(fā)光譜波峰約在360nm處，發(fā)射光譜波峰約在480nm處,。通過檢測這些特定波長附近的熒光信號,，可以表征細胞內(nèi)的膽固醇含量。

2）染色步驟^[2]

① 菲律平染色液配制：

a.母液準(zhǔn)備：1mg菲律平粉末中加入1mL DMSO,，完quan溶解配置成1mg/mL儲存液,，按照單次用量分裝凍存，避免反復(fù)凍融,，避光保存,。

b.工作液準(zhǔn)備：使用前，取適量母液加入到PBS中,，稀釋成一定濃度的工作液（如0.1mg/mL）備用,。

② 將細胞接種于蓋玻片中，培養(yǎng)12-18h,；

③ 用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次后,，在室溫下用4%多聚甲醛固定20min；

④ 室溫下用0.1mg/mL菲律平III處理細胞30min,；

⑤ 細胞再用0.35μg/mL碘化丙啶(PI)染色5min,；

⑥ 最后，用共聚焦激光掃描顯微鏡在405nm處檢測菲律平和PI染色的熒光強度,。

3）星形膠質(zhì)細胞/神經(jīng)元細胞菲律平染色結(jié)果圖

（注：圖片來源于文獻[2]）

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[1] Ji X, Ma Q, Wang X, et al. Digeda-4 decoction and its disassembled prescriptions improve dyslipidemia and apoptosis by regulating AMPK/SIRT1 pathway on tyloxapol-induced nonalcoholic fatty liver disease in mice[J]. J Ethnopharmacol. 2023;317:116827.

[2] Huang Y, Zhang W, Guo X, et al. Cellular cholesterol loss by DHCR24 knockdown leads to Aβ production by changing APP intracellular localization[J]. J Lipid Res. 2023;64(5):100367.

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