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概述：

生命誕生于3D環(huán)境,，所以傳統(tǒng)的2D細(xì)胞培養(yǎng)方法，雖然可以保證細(xì)胞的生長(zhǎng)和對(duì)外界刺激產(chǎn)生生理反應(yīng),，但是和實(shí)際生活環(huán)境的巨大差異會(huì)導(dǎo)致大部分生理功能受限,。比如，2D培養(yǎng)環(huán)境下的細(xì)胞間的相互作用是XY軸的,，只是細(xì)胞層之間的作用,，缺乏Z軸方向的影響，這樣就沒有養(yǎng)料,、氧氣和外界刺激物（如：藥物處理）的梯度滲透作用,。而3D培養(yǎng)環(huán)境下細(xì)胞可以變成細(xì)胞球，從而可以體現(xiàn)出Z軸細(xì)胞之間的力作用和各種物質(zhì)的滲透梯度,，和體內(nèi)的差異相較2D細(xì)胞層會(huì)大大縮小,，從而提高體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。利用體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞來高通量的篩選新的有效的藥物對(duì)于挽救癌癥病人非常重要,。

本期小愛帶大家學(xué)習(xí)腫瘤球培養(yǎng)過程,，介紹3種培養(yǎng)攻略：3D腫瘤球瓊脂糖-基質(zhì)膠培養(yǎng)攻略、3D腫瘤球基質(zhì)膠培養(yǎng)攻略,、3D腫瘤球超低吸附培養(yǎng)攻略,。

一、3D腫瘤球瓊脂糖-基質(zhì)膠培養(yǎng)攻略

以乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF-7為例制備3D多細(xì)胞腫瘤球并采用倒置顯微鏡,、激光共聚焦顯微鏡和環(huán)境掃描電鏡對(duì)其進(jìn)行詳細(xì)表征,。

實(shí)驗(yàn)步驟：

1、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備工作

1）提前24h取12mL DMEM(abs9483)和RPMI 1640(abs9484)培養(yǎng)基（含10%FBS(abs972),，下同）于50mL離心管內(nèi),，置于4℃冰箱中預(yù)冷；
2）將分裝好的Matrigel基質(zhì)膠(abs9490)提前24h從-20℃放入4℃,，使其融化成液體狀態(tài),；
3）將無菌的1mL移液器槍頭放入無菌50mL離心管內(nèi)，置-20℃冰箱預(yù)冷,。

2,、瓊脂糖包被96孔板

1）準(zhǔn)確量取6mL RPMI 1640培養(yǎng)基（或DMEM培養(yǎng)基）于2個(gè)10mL的注射玻璃瓶?jī)?nèi)，加入90mg瓊脂糖(abs44056213),，蓋塞后放入80℃的水浴鍋內(nèi)加熱溶解30min,；
2）加熱結(jié)束后，將注射瓶放入滅菌鍋內(nèi),，115℃滅菌30min,；
3）滅菌完成后,，迅速取出注射瓶放入超凈臺(tái)內(nèi)。將注射瓶?jī)?nèi)的瓊脂糖溶液倒入無菌的加樣槽中,，用多通道移液器以每孔60μL的量加入96孔板內(nèi)。

注意：由于瓊脂糖溶液在室溫時(shí)會(huì)凝固,，因此從滅菌鍋內(nèi)取出瓊脂糖溶液后一定要快速轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)內(nèi)并迅速加入至96孔板中,。

此外，為保證加樣時(shí)瓊脂糖不冷卻,，需要同時(shí)滅菌加樣槽和100μL的移液器槍頭,。

4）加入完成后，96孔板要保持水平約30min使孔內(nèi)的瓊脂糖凝固,。

3,、配置含Matrigel基質(zhì)膠細(xì)胞懸液

1）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞（或MCF-7細(xì)胞），胰蛋白酶(abs47014938)消化后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),，用RPMI 1640培養(yǎng)基（或DMEM培養(yǎng)基）將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整至2.0×10⁵cells/mL,，備用；
2）將盛滿碎冰的燒杯噴完酒精后放入超凈臺(tái)內(nèi),，將RPMI 1640培養(yǎng)基以及解凍的Matrigel基質(zhì)膠從冰箱內(nèi)取出置于冰上,；

注意：由于Matrigel基質(zhì)膠在室溫下溶液凝固，因此在操作過程中一定要保持低溫,。

3）將預(yù)冷的移液器槍頭取出放置于超凈臺(tái)內(nèi),。根據(jù)計(jì)算量（2.5%，v/v）用移液器將300μL Matrigel基質(zhì)膠加入到12mL RPMI 1640培養(yǎng)基內(nèi),，迅速混勻,；

注意：由于Matrigel基質(zhì)膠在室溫下溶液凝固，因此使用的移液器槍頭也需要預(yù)冷,。

4）加入步驟1中的細(xì)胞懸液（約600μL）,，使細(xì)胞濃度為10000cells/mL，迅速混勻,，備用,；

4、將細(xì)胞懸液鋪入瓊脂糖包被的96孔板

1）將上述步驟4中配置好的含有Matrigel基質(zhì)膠的細(xì)胞懸液放入加樣槽內(nèi),，用多通道移液器吸取200μL加入到包被瓊脂糖的96孔板內(nèi),；
2）采用微孔板離心機(jī)(abs72035)進(jìn)行離心，離心條件為4℃,，1000×g,，10 min。

注意：離心96孔板時(shí)為保持無菌,，將96孔板的周圍用封口膜封住,。

3）離心完成后,，取出96孔板，摘下封口膜,，噴灑酒精后放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),。整個(gè)培養(yǎng)流程如圖1所示。

圖1

4）在培養(yǎng)的第3,、5和7天,，更換孔內(nèi)的100μL培養(yǎng)基并采用倒置顯微鏡觀察腫瘤球的形態(tài)。

圖2

5）若要采用3D多細(xì)胞腫瘤球進(jìn)行藥物試驗(yàn),，在培養(yǎng)7天后,，用移液器取出孔內(nèi)的100μL培養(yǎng)基，加入100μL給藥溶液,，然后置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)并定期采用倒置顯微鏡觀察腫瘤球的生長(zhǎng)狀況（圖2）,。

5、3D多細(xì)胞腫瘤球的表征

1）倒置顯微鏡觀察3D多細(xì)胞腫瘤球形態(tài)：直接將96孔板置于倒置顯微鏡下觀察即可,。
2）激光共聚焦顯微鏡觀察：用移液器小心取出孔內(nèi)的腫瘤球,，用PBS清洗3遍后，采用4%多聚甲醛(abs9179)固定,，并用Hoechst 33258(abs47047617)對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色,，PBS清洗3遍后在激光共聚焦顯微鏡下觀察（圖3）。

圖3

3）環(huán)境掃描電鏡觀察：用移液器小心取出孔內(nèi)的腫瘤球,，用PBS(abs962)清洗3遍后,，固定干燥后進(jìn)行環(huán)境掃描電鏡觀察（圖4）。

圖4

常見問題：

在實(shí)踐中,，我們常常面臨細(xì)胞無法成球狀的問題,。下面我們探討3D細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)胞不能成球狀的原因，以及針對(duì)這些問題的解決方法,。

1,、細(xì)胞類型和特性：

細(xì)胞的類型和特性是影響其在3D環(huán)境中形成球狀結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵因素之一。不同類型的細(xì)胞具有不同的自組織和黏附性能,，可能更適合形成其他類型的3D結(jié)構(gòu),，如片狀、管狀等,。
解決方法：在進(jìn)行3D培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)之前,，必須仔細(xì)選擇適合自組織的細(xì)胞類型。對(duì)于不易形成球狀結(jié)構(gòu)的細(xì)胞,，可以嘗試使用誘導(dǎo)因子或基因調(diào)控方法來促進(jìn)其自組織能力,。

2、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)缺乏或不適當(dāng)：

細(xì)胞成球狀通常需要適當(dāng)?shù)募?xì)胞外基質(zhì)支持。如果培養(yǎng)基中的ECM成分不足或不適當(dāng),，細(xì)胞可能無法形成球狀,。
解決方法：合理設(shè)計(jì)培養(yǎng)基中的ECM成分，確保細(xì)胞有足夠的支持來形成球狀結(jié)構(gòu),。此外,，可以考慮添加外源性ECM支持物質(zhì)，如適當(dāng)?shù)?strong>基質(zhì)蛋白,、生物活性的材料等,。

3、細(xì)胞密度不足：

細(xì)胞成球狀可能需要足夠的細(xì)胞密度來支持細(xì)胞間的相互作用和自組織,。如果細(xì)胞密度過低，可能會(huì)影響球狀結(jié)構(gòu)的形成,。
解決方法：優(yōu)化細(xì)胞接種密度,，確保足夠的細(xì)胞數(shù)參與自組織過程。

4,、培養(yǎng)條件不適當(dāng)：

培養(yǎng)條件如培養(yǎng)基成分,、溫度、氧氣濃度等可能會(huì)影響細(xì)胞成球狀的能力,。不適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件可能阻礙了細(xì)胞的自組織能力,。
解決方法：通過優(yōu)化培養(yǎng)條件，創(chuàng)造一個(gè)更有利于細(xì)胞自組織的環(huán)境,，例如調(diào)整培養(yǎng)基成分,、溫度和氣體濃度。

二,、3D腫瘤球基質(zhì)膠培養(yǎng)攻略

1,、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備工作

1）準(zhǔn)備好細(xì)胞培養(yǎng)試劑；

2）將分裝好的Matrigel基質(zhì)膠(abs9495)提前24h從-20℃放入4℃,，使其融化成液體狀態(tài),；將無菌的1mL移液器槍頭放入無菌50mL離心管內(nèi)，置-20℃冰箱預(yù)冷,。

2,、加膠點(diǎn)板

1）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，胰蛋白酶消化后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)（例如24孔板,，一孔點(diǎn)25uL基質(zhì)膠細(xì)胞混懸液,，細(xì)胞數(shù)量7000/25uL基質(zhì)膠），取特定細(xì)胞數(shù)300g,，4℃,，離心5min，棄上清,，取細(xì)胞沉淀備用,；
2）解凍的Matrigel基質(zhì)膠從冰箱內(nèi)取出置于金屬冰盒上（也可以用盛滿碎冰的燒杯噴完酒精后放入超凈臺(tái)內(nèi)）,；

注意：由于Matrigel基質(zhì)膠在室溫下溶液凝固，因此在操作過程中一定要保持低溫,，槍頭,，EP管，離心管,，金屬冰盒要提前-20℃預(yù)冷,。

3）向細(xì)胞沉淀加入基質(zhì)膠（金屬冰盒或冰上操作），迅速混勻并點(diǎn)板（控制在半分鐘為佳,，時(shí)間久了基質(zhì)膠會(huì)凝集產(chǎn)生氣泡）,。以24孔細(xì)胞培養(yǎng)板為例，每孔點(diǎn)膠25uL組織基質(zhì)膠混合物（呈液滴狀）,，將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中10-15min成膠,，添加500-750μL培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；
4）在培養(yǎng)的第3,，5,，7天，給細(xì)胞球換液,，并采用倒置顯微鏡觀察腫瘤球形態(tài),；
5）若采用3D多細(xì)胞腫瘤球進(jìn)行藥物試驗(yàn)，在培養(yǎng)7天后,，用移液器取出孔內(nèi)的100uL培養(yǎng)基,，加入100uL給藥溶液，然后至于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)并定期采用倒置顯微鏡觀察腫瘤球生長(zhǎng)狀況,。

3,、3D多細(xì)胞腫瘤球表征

1）倒置顯微鏡觀察：直接將96孔板置于顯微鏡下觀察即可；

2）激光共聚焦顯微鏡觀察：用移液器小心取出孔內(nèi)腫瘤球,，用PBS清洗3遍,，采用4%多聚甲醛(abs9179)固定，并用Hoechst33258(abs811667),，PBS洗3遍后在激光共聚焦顯微鏡下觀察,；

3）環(huán)境掃描電鏡觀察：用移液器小心取出孔內(nèi)的腫瘤球，用PBS清洗3遍后,，固定干燥后進(jìn)行環(huán)境掃描電鏡觀察,。

三、3D腫瘤球超低吸附培養(yǎng)攻略

以乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF-7為例制備3D多細(xì)胞腫瘤球并采用倒置顯微鏡,、激光共聚焦顯微鏡和環(huán)境掃描電鏡對(duì)其進(jìn)行詳細(xì)表征,。

1、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備工作

1）提前24h取12mL DMEM(abs9483)和RPMI 1640(abs9484)培養(yǎng)基（含10%FBS(abs972)，下同）于50mL離心管內(nèi),，置于4℃冰箱中預(yù)冷,；
2）瓊超低吸附培養(yǎng)板（96孔板，圓底）(abs7060),。

2,、配置細(xì)胞懸液

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞（或MCF-7細(xì)胞），胰蛋白酶(abs47014938)消化后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),，用RPMI 1640培養(yǎng)基（或DMEM培養(yǎng)基）將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整至1.43 x 10⁵cells/mL（即10000細(xì)胞/70μL）或其他濃度（即2500細(xì)胞/70μL,，500細(xì)胞/70μL，100細(xì)胞/70μL）,，根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)需求選擇其中一個(gè)濃度或配置適合自己實(shí)驗(yàn)的濃度,。

3、將細(xì)胞懸液鋪入超低吸附96孔板

1）將上述步驟2中配置好的細(xì)胞懸液放入加樣槽內(nèi),，使用移液器輕輕吹打細(xì)胞懸液以保證濃度均一,，用多通道移液器吸取細(xì)胞懸液加入到超低吸附96孔板內(nèi)，每孔70μL,。
2）蓋上板蓋,，室溫下離心,，250 RCF,，2min；

注意：離心96孔板時(shí)為保持無菌,，將96孔板的周圍用封口膜封住,。

3）離心完成后，取出96孔板,，摘下封口膜,，噴灑酒精后放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，并保持斜立（與水平面夾角30度,，如下圖）,，此過程可以將培養(yǎng)板的一側(cè)墊高；

圖5

4）在培養(yǎng)的第3,、5和7天,，更換孔內(nèi)的100μL培養(yǎng)基并采用倒置顯微鏡觀察腫瘤球的形態(tài)；
5）若要采用3D多細(xì)胞腫瘤球進(jìn)行藥物試驗(yàn),，在培養(yǎng)7天后,，用移液器取出孔內(nèi)的100μL培養(yǎng)基，加入100μL給藥溶液,，然后置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)并定期采用倒置顯微鏡觀察腫瘤球的生長(zhǎng)狀況,。

4、3D多細(xì)胞腫瘤球的表征

1）倒置顯微鏡觀察3D多細(xì)胞腫瘤球形態(tài)：直接將96孔板置于倒置顯微鏡下觀察即可；
2）激光共聚焦顯微鏡觀察：用移液器小心取出孔內(nèi)的腫瘤球,，用PBS清洗3遍后,，采用4%多聚甲醛(abs9179)固定，并用Hoechst 33258(abs47047617)對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色,，PBS清洗3遍后在激光共聚焦顯微鏡下觀察,；
3）環(huán)境掃描電鏡觀察：用移液器小心取出孔內(nèi)的腫瘤球，用PBS(abs962)清洗3遍后,，固定干燥后進(jìn)行環(huán)境掃描電鏡觀察,。

今天講解就到這了，大家如有3D腫瘤球或類器官問題,，歡迎公眾號(hào)“愛必信生物"后臺(tái)交流哦,！

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