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微生物制劑可加重炎癥性疾病，如多發(fā)性硬化癥(MS),，該疾病研究常用的動物模型為實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE),。百日咳毒素(PTX)是微生物制劑的一種，它是一種細(xì)菌毒力因子,，通常被用作促進(jìn)EAE的佐劑,。

需要注意的是，EAE模型誘導(dǎo)的成功率受多種因素的影響,，包括小鼠的種類和性別,、百日咳毒素的劑量、佐劑的使用以及豐富的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和建模經(jīng)驗(yàn),。此外,，在特定應(yīng)用中，每個批次都要確定最佳劑量,。

保存和溶解方法：

保存：我司提供的百日咳毒素為無菌包裝的凍干粉,，在真空下密封。重溶前后在4°C下可儲存6個月,，避免凍融,；

溶解：百日咳毒素溶于水，可用無菌水或無菌緩沖液重溶,。使用前,，應(yīng)輕柔搖晃，使懸液混合均勻,。如果需要長期儲存,，可以在高離子強(qiáng)度緩沖液中進(jìn)行重溶，如無菌0.1M磷酸鈉溶液,、pH 7.0,；0.5M氯化鈉溶液（注意：溶解時輕柔處理，不要進(jìn)行劇烈漩渦震蕩）,。

EAE模型文獻(xiàn)分享：

在百日咳毒素作為佐劑促進(jìn)EAE模型的機(jī)制探究中,，Aline Dumas等人曾報道，PTX會觸發(fā)IL-6介導(dǎo)的信號級聯(lián)反應(yīng),，通過在血管內(nèi)表面爬行來增加巡邏血管的白細(xì)胞數(shù)量,。隨后,，Aline Dumas等人又進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)PTX通過其ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶活性誘導(dǎo)：

1）髓樣細(xì)胞中的TLR4信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致促IL-1β合成,；
2）一種依賴pyrin的炎性復(fù)合物,，將促IL-1β裂解為其活性形式。然后,，IL-1β刺激附近的基質(zhì)細(xì)胞分泌IL-6,。

在沒有pyrin的情況下，PTX不會誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞與大腦毛細(xì)血管的黏附,，并且在誘導(dǎo)具有腦源性T淋巴細(xì)胞小鼠的EAE方面效果較差,。該研究確定了激活pyrin的第一個微生物分子PTX，感染后可能影響MS的機(jī)制,，也是免疫疾病的潛在治療靶點(diǎn),。

EAE誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)方法：

1、主動免疫誘導(dǎo)EAE

1）小鼠兩側(cè)皮下注射200μL乳劑,。乳劑中含有300μg MOG(35-55)肽（溶解于生理鹽水中）,，并與等量的FCA混合；

2）免疫后即刻和免疫后第2天分別給予小鼠腹腔注射PTX(20μg/kg),。

2,、通過過繼轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)EAE

1）給小鼠腹腔注射2×10⁷個從免疫誘導(dǎo)EAE后8天處死的小鼠腹部淋巴結(jié)和脾臟中分離的淋巴細(xì)胞；

2）然后在補(bǔ)充有MOG(35-55)肽(15μg/mL),、小鼠IL-12(5ng/mL),、小鼠IL-23(20ng/mL)，F(xiàn)BS(10%),、1%改良的Eagle培養(yǎng)基（含非必需氨基酸）,、青霉素(100U/mL)、鏈霉素(100μg/mL)和兩性霉素B(250ng/mL)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天,。

3、EAE癥狀的評估

小鼠每日體重和評分如下：

0：無疾病跡象,；0.5：部分尾部癱瘓,；1：尾部癱瘓；1.5：一側(cè)后肢無力,；2：雙后肢無力,；2.5：后肢部分癱瘓；3：后肢癱瘓,；3.5：前肢部分癱瘓,；4：前肢癱瘓；5：因人道原因死亡或死亡,。

PTX需要Pyrin來誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞在血管內(nèi)爬行,，并最大限度地促進(jìn)EAE,。

本期小愛為大家介紹了百日咳毒素作為促進(jìn)EAE模型的佐劑，在使用過程中的注意事項(xiàng)以及文獻(xiàn)常用的造模方法,。PTX具有多種生物學(xué)活性,，能引起百日咳眾多的臨床癥狀，同時也是主要的免疫原,。與大多數(shù)哺乳動物培養(yǎng)細(xì)胞結(jié)合并特定靶向G蛋白,，抑制G蛋白及其在信號通路中的生理功能。正是依賴Gi家族的蛋白偶聯(lián)受體來抑制信號通路的能力,，使得PTX成為細(xì)胞生物學(xué)研究中的一種重要工具,。

Dumas A , Amiable N , Vaccari J P D R ,et al.The Inflammasome Pyrin Contributes to Pertussis Toxin-Induced IL-1β Synthesis, Neutrophil Intravascular Crawling and Autoimmune Encephalomyelitis[J].PLoS Pathogens, 2014, 10(5):e1004150.

免責(zé)聲明：EAE模型誘導(dǎo)的成功率受多種因素的影響，本文中提供的造模方法來源于已發(fā)表的文獻(xiàn),，僅供您參考,，希望對您成功構(gòu)建模型有所幫助。

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