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染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)的原理是在活細胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)-DNA復合物,，并將其隨機切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過免疫學方法沉淀此復合體,，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段,，通過對目的片斷的純化與檢測,，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息,。

一、細胞交聯(lián)與裂解

在裝有20ml生長培養(yǎng)基的150mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)貼壁細胞,，長到80%-90%密度,，約10⁷個細胞。如有必要,，可進行刺激或處理,。建議采用1×10⁶個細胞作為一次ChIP的細胞量。

1）在20ml培養(yǎng)基中加入終濃度為1%的甲醛,，輕輕渦旋培養(yǎng)皿混勻,，使細胞在甲醛中固定，室溫固定10分鐘（對于轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄輔因子,，可適當延長交聯(lián)時間,，但不超過30分鐘）。加入甲醛后培養(yǎng)基的顏色會發(fā)生改變,；

2）在培養(yǎng)皿中加入濃度為0.125M的甘氨酸,，輕輕渦旋混勻，室溫反應5分鐘,，淬滅未反應的甲醛,，終止交聯(lián)。加入甘氨酸后培養(yǎng)基的顏色會發(fā)生改變,；

3）棄培養(yǎng)基,，20ml預冷的1×PBS洗滌細胞，重復洗滌一次,；

4）在培養(yǎng)皿中加入2ml 預冷的含蛋白酶抑制劑混合物的1×PBS,；使用細胞刮收集細胞，4°C,，800g,，離心5分鐘,；

5）去除上清液（此步細胞可在液氮中快速冷卻，存放于-80°C保存幾個月）,，細胞再次重懸于0.5ml含蛋白酶抑制劑混合物的細胞裂解緩沖液中,，冰上孵育15分鐘，每5分鐘渦旋一次,；

6）4°C,，800g，離心5分鐘,。小心去除上清液,，加入0.5ml含蛋白酶抑制劑混合物的細胞核裂解緩沖液，使其重懸,。

二,、超聲處理片段化 DNA

超聲處理的效果取決于細胞類型、細胞濃度和儀器,。需要通過預實驗確定超聲的最佳條件,，以便將交聯(lián)DNA剪切為如上圖的約200-1000bp長度。染色質(zhì)片段化對于ChIP實驗成功很關(guān)鍵,。片段化不足會導致樣本丟失,，片段化過度會破壞靶標蛋白表位、降低ChIP效率,。在超聲過程中,，保持樣品一直處于冰上低溫狀態(tài)。不要使探頭接觸超聲管底部或管壁,，如超聲過程產(chǎn)生泡沫,，需暫停超聲并調(diào)整超聲管位置。

超聲處理后,，4°C,，12000g離心10分鐘。離心后,，留取5μl染色質(zhì)溶液進行瓊脂糖凝膠分析,，以檢測超聲效率?？蓪⒊暻昂统暫蟾魅〉?μl染色質(zhì)溶液對比分析,。

圖1 超聲前超聲后

三、靶蛋白和DNA 免疫共沉淀

將下述緩沖液放于冰上保存：低鹽洗滌緩沖液高鹽洗滌緩沖液,，LiCl洗滌緩沖液和TE洗滌緩沖液,。配制450μl稀釋緩沖液（含蛋白酶抑制劑混合物），冰上保存,。如有多個樣品可合并配制,。

1）取上述50μl離心后的裂解液上清加入到新的離心管中,，作為一次免疫沉淀實驗的DNA混合物樣本。每50μl 裂解液中含有1×10⁶個細胞裂解產(chǎn)物,。ChIP反應包括陽性對照抗體管,、陰性對照IgG管和目的蛋白抗體管。推薦陰性對照IgG和目的抗體使用同一物種來源,。

2）在上述50μl片段化染色質(zhì)樣品的離心管中加入上述配制好的450μl稀釋緩沖液,，充分混勻。每管取5μl樣品于新的離心管中作為實驗的1% “input",，用于實驗的優(yōu)化與數(shù)據(jù)處理,，保存于4°C，直至蛋白DNA復合物洗脫與解交聯(lián)步驟,。

3）取完inpμt的離心管中分別加入1-10μg免疫沉淀抗體,，4°C轉(zhuǎn)子上孵育4h以上或過夜。

4）每個離心管中加入20μl蛋白A/G磁珠（建議將吸頭前端剪去一小部分后再吸取磁珠）,，4°C轉(zhuǎn)子上孵育2h,。

5）磁力架吸附，靜置1-2分鐘,，去上清。按如下步驟洗滌蛋白A/G磁珠-抗體-蛋白/DNA復合物：

低鹽洗滌緩沖液,，4°C轉(zhuǎn)子上孵育3-5分鐘,，洗滌一次；

高鹽洗滌緩沖液,，4°C轉(zhuǎn)子上孵育3-5分鐘,，洗滌一次；

LiCl 洗滌緩沖液,，4°C轉(zhuǎn)子上孵育3-5分鐘,，洗滌一次；

注：使用前將等體積A液及B液混勻,，請勿提前混勻,，否則會導致出現(xiàn)沉淀析出。TE 緩沖液,，4°C轉(zhuǎn)子上孵育3-5分鐘,，洗滌一次。

圖2 靶蛋白和DNA免疫共沉淀示意圖

四,、洗脫和解交聯(lián)

實驗前準備：解凍蛋白酶K,；ChIP洗脫緩沖液恢復至室溫，以確保SDS溶解,；配制洗脫緩沖液,；ChIP洗脫緩沖液100μl+蛋白酶K 1μl（多個樣本可合并配制）,。

1）樣品管及Input管加入ChIP洗脫緩沖液（含蛋白酶K）；

2）62°C孵育2小時,；

3）在95°C下培養(yǎng)10分鐘,；

4）讓樣品冷卻至室溫；

5）10000g離心10秒收集管蓋及管壁上殘留樣品,，采用磁力架分離磁珠,。將上清液小心轉(zhuǎn)移至一個新的試管中。

五,、DNA 純化

采用純化柱進行DNA純化（免疫沉淀和input）,。

六、鑒定分析

QPCR或者高通量測序的方法檢測IP得到的DNA,。

七,、常見問題

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