一,、前言：
多重?zé)晒饷庖呓M化(mIHC)主要的技術(shù)原理來(lái)自TSA技術(shù)，TSA即酪酰胺信號(hào)放大,，是一類利用辣根過氧化酶(HRP)對(duì)靶蛋白或核酸進(jìn)行高密度原位標(biāo)記的酶學(xué)檢測(cè)方法,。用這種方法做多重?zé)晒馊旧抢枚股蠋в械腍RP（而不是直接偶聯(lián)熒光素），來(lái)催化后續(xù)添加入體系的非活性熒光素,，該熒光素在HRP和過氧化氫的作用下被活化,，跟臨近蛋白的酪氨酸殘基共價(jià)偶聯(lián)，使得蛋白樣品與熒光素穩(wěn)定結(jié)合,。然后進(jìn)行微波處理,，前一輪非共價(jià)結(jié)合的抗體被洗掉，共價(jià)結(jié)合的熒光素還留存在樣品上,。再換個(gè)一抗來(lái)第二輪孵育,，周而復(fù)始,。等到所有抗體孵育結(jié)束,，熒光素都結(jié)合好后，最后去檢測(cè)結(jié)果,。
因?yàn)樯婕暗蕉啻挝⒉?，似乎也只有石蠟切片能?jīng)得起這番造作，而手中只有冰凍樣本的老師,，以往只能望洋興嘆,，因?yàn)楸鶅銮衅?jīng)不起甚至一輪的熱處理。但隨著技術(shù)的發(fā)展,，這個(gè)難題也在逐漸被攻克,，為了使得更多老師能夠用上mIHC這項(xiàng)技術(shù)，Absin推出了抗體洗脫液(abs994),，現(xiàn)在一起來(lái)看看冰凍切片的多色實(shí)驗(yàn)該如何開展吧~
二,、建議操作步驟：
1、樣本準(zhǔn)備
1）固定包埋：獲取新鮮組織,，用4%多聚甲醛低溫固定,，PBS緩沖液洗三次，每次15min,；30%蔗糖沉降脫水,，OCT包埋；
2）切片：使用冷凍切片機(jī),，將組織冰切成3-5μm的切片（對(duì)于儲(chǔ)存在-80℃下的組織,，制備切片前,，需轉(zhuǎn)移到-20℃冰箱中平衡約15min），粘貼于防脫載玻片上,，室溫晾片30-60min,。切片放入PBS中浸洗3次，每次5min,，去除OCT,；
3）淬滅內(nèi)源性過氧化物酶：滴加3% H2O2，室溫下孵育10-30min,，PBS浸洗5min×3次,。
2、多色實(shí)驗(yàn)
1）封閉：滴加封閉液,，室溫孵育30min,，除去封閉液；
2）一抗孵育：棄封閉液,，滴加稀釋好的的一抗工作液,，于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過夜或37℃ 1-2h（濕盒中可加少量水，防止抗體孵育過程干片）,，PBS浸洗5min×3次,；
3）二抗孵育：滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP二抗覆蓋組織，避光室溫孵育20-50min,，PBS浸洗5min×3次,；
4）染料孵育：滴加現(xiàn)配的1*TSA染料工作液（使用信號(hào)放大液按1:100稀釋），反應(yīng)2-15min,，PBS浸洗5min×3次,；
5）抗體洗脫：滴加適量37℃預(yù)熱至充分溶解的抗體洗脫液(abs994)覆蓋樣本，10s后甩去,，再次滴加抗體洗脫液沒過整個(gè)樣本并稍微鼓起,，37℃濕盒孵育5-20min（根據(jù)切片厚度，一抗種類調(diào)整洗脫溫度和時(shí)間,，洗脫難度：結(jié)構(gòu)性膜蛋白和細(xì)胞骨架蛋白＞胞漿蛋白＞胞核蛋白）,，PBS浸洗5min×3次；
6）重復(fù)進(jìn)行[1封閉→5抗體]洗脫過程,，直到完成所有指標(biāo)染色,；
7）滴加1*DAPI工作液到樣品上，浸沒樣本區(qū)域,，室溫孵育10min,，PBS浸洗5min×3次；
8）滴加抗熒光淬滅封片劑，用蓋玻片封片,，避免氣泡,；
9）掃描成像，數(shù)據(jù)分析,。
三,、注意事項(xiàng)：
1、若某些抗體難以洗脫,，建議降低一抗稀釋比例,，或?qū)⒃摪悬c(diǎn)排到最后一輪進(jìn)行染色；
2,、抗體洗脫液在使用時(shí)要根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整孵育時(shí)間和洗脫溫度,，若時(shí)間太長(zhǎng)有可能損傷抗原靶點(diǎn)以及細(xì)胞核形態(tài)；
3,、請(qǐng)?jiān)诎裰跋裙潭颖?，切片后固定可能不耐受多次?biāo)記與洗脫；
4,、冰凍切片請(qǐng)控制切片厚度不超過5um,，太厚的樣本可能影響染色效果。
雖然抗體洗脫液解決了冰凍切片無(wú)法熱修復(fù)的問題,，但多輪洗脫依舊可能存在脫片的情況,，可用白片進(jìn)行多次抗體洗脫判斷片子的耐受情況，來(lái)決定最終染色的靶點(diǎn)數(shù)量,。
貨號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 貨期 |
abs50012 | 四色多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒（鼠兔二抗） | 20T | 現(xiàn)貨 |
abs50028 | 四色多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒（兔二抗） | 20T | 現(xiàn)貨 |
abs50013 | 五色多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒（鼠兔二抗） | 20T | 現(xiàn)貨 |
abs50029 | 五色多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒（兔二抗） | 20T | 現(xiàn)貨 |
abs50014 | 六色多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒（鼠兔二抗） | 20T | 現(xiàn)貨 |
abs50030 | 六色多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒（兔二抗） | 20T | 現(xiàn)貨 |
abs50037 | 七色多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒plus（鼠兔二抗） | 20T | 現(xiàn)貨 |
abs50038 | 七色多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒plus（兔二抗） | 20T | 現(xiàn)貨 |
abs994 | 抗體洗脫液（mIHC專用） | 30ml | 現(xiàn)貨 |
好消息,！Absin文獻(xiàn)獎(jiǎng)勵(lì)重磅升級(jí),！
Absin特色產(chǎn)品線：
WB相關(guān)：ECL發(fā)光液,、預(yù)染marker、預(yù)制膠,；IHC相關(guān)：二抗試劑盒,、組化筆；IP/CoIP試劑盒,；激動(dòng)劑/抑制劑,；血清、BSA,、蛋白酶K,、CTB、TTX,、CEE,；凋亡試劑盒；呼吸爆發(fā)試劑盒；ELISA試劑盒,；重組蛋白,；抗體: 二抗、標(biāo)簽抗體,、對(duì)照抗體,；定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測(cè))...
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