針對(duì)樣品的常見(jiàn)問(wèn)題：
Q：細(xì)胞水平要做Western Blot,，多少細(xì)胞提的蛋白夠Western Blot,？
A：一般地5* 106就足夠了,。
Q: 同一樣品能同時(shí)提RNA又提蛋白嗎，這樣對(duì)Western Blot有無(wú)影響?
A：能,，沒(méi)有問(wèn)題的,。
Q: 同一蛋白樣品能同時(shí)進(jìn)行兩種因子的Western Blot檢測(cè)嗎？
A：當(dāng)然可以，有的甚至可以同時(shí)測(cè)幾十種樣品,。
Q: 如果目標(biāo)蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白,，操作需要注意什么？
A: 如果是膜蛋白和胞漿蛋白,，所用的去垢劑就要溫和得多,，這時(shí)建議加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。
Q: 蛋白變性后可以存放多久,？
A：－80℃,，一兩年沒(méi)有問(wèn)題。zui關(guān)鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉,；不要被細(xì)菌消化掉(也是被酶水解了),。
Q: 如果上樣量超載，要用什么方法來(lái)增加上樣量,？如果需要加大上樣量使原來(lái)弱的條帶能看清楚,。
A：可以濃縮樣品，也可以根據(jù)你的目標(biāo)分子量透析掉一部分小分子蛋白,。一般地,，超載30％是不會(huì)有問(wèn)題的。如果已經(jīng)超了不少了,，而且小分子量的也要,，可以考慮加大膠的厚度，可以試試1.5mm厚度的凝膠,。
Q: 接下來(lái)我準(zhǔn)備采用DAB顯色技術(shù),，二抗是生物素化的多克隆抗體，三抗是親和素生物素體系,，不知采用這樣的方案后,，封閉液是否要作調(diào)整，能否再用5％的脫脂奶粉呢,？好像有資料說(shuō)脫脂奶粉會(huì)影響親和素生物素的生成,，是嗎？
A：不能使用脫脂奶粉,，因?yàn)槊撝谭壑泻锼?，用BSA代替應(yīng)該好一點(diǎn)，此外如果用于磷酸化指標(biāo)蛋白的檢測(cè)時(shí)也不能用脫脂奶粉,，因?yàn)槊撝谭壑泻欣业鞍住?/span>
Q：一般一次上樣的蛋白總量是多少,，跟目的蛋白的表達(dá)量有關(guān)系嗎？
A：Western Blot一般上樣30－100微克不等,，結(jié)果跟目的蛋白的豐度,、上樣量,、一二抗的量和孵育時(shí)間都有關(guān)系，也與顯色時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān),。開(kāi)始摸條件時(shí),，為了拿到陽(yáng)性結(jié)果，各個(gè)步驟都可以量多一點(diǎn)時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn),，當(dāng)然背景也就出來(lái)了,。要拿到好的結(jié)果，如果抗體好的話比較容易,，抗體不好的話就需要反復(fù)地試了,，當(dāng)然有的不適合Western Blot的怎樣做也不行。所以拿到好的結(jié)果不容易,。
Q: 做組織樣品的western的時(shí)候,，處理樣品有什么訣竅嗎？還有,，您用過(guò)大牛血清做封閉劑嗎,？濃度如何？效果是不是比BSA好一點(diǎn),？
A：組織樣品必須進(jìn)行研磨、勻漿超聲處理,，蛋白質(zhì)溶解度會(huì)更好,，離心要充分，膜蛋白需用更劇烈的方法抽提,，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心),。還有一點(diǎn)就是組織中的蛋白酶活性更強(qiáng)，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入PMSF和蛋白酶抑制劑 cocktail）,，封閉劑一般5%脫脂奶粉較常用,。如果一抗為多克隆抗體，使用BSA也是不錯(cuò)的選擇,。
Q: 大分子量蛋白200 kD,，在做western要注意什么呢？
A：做200kd蛋白的Western Blot時(shí)要注意,，分離膠建議選擇>7%的,；剝膠時(shí)要小心；轉(zhuǎn)移時(shí)間需要相應(yīng)延長(zhǎng),；要做分子量參照（否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析）,。
Q：蛋白的上樣量有沒(méi)有什么具體的要求？
A：上樣量要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求來(lái)定， 如果要求是定量和半定量的Western Blot 則上樣量要均等,， 如果只是要定性，則沒(méi)有太大的關(guān)系， 盡量多上就行了,， 但是不要超過(guò)0.3μg/mm2。
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