針對樣品的常見問題：
Q：細(xì)胞水平要做Western Blot,，多少細(xì)胞提的蛋白夠Western Blot,？
A：一般地5* 106就足夠了。
Q: 同一樣品能同時提RNA又提蛋白嗎,，這樣對Western Blot有無影響?
A：能,，沒有問題的,。
Q: 同一蛋白樣品能同時進(jìn)行兩種因子的Western Blot檢測嗎？
A：當(dāng)然可以,，有的甚至可以同時測幾十種樣品,。
Q: 如果目標(biāo)蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白，操作需要注意什么,？
A: 如果是膜蛋白和胞漿蛋白,，所用的去垢劑就要溫和得多，這時建議加上NaF去抑制磷酸化酶的活性,。
Q: 蛋白變性后可以存放多久,？
A：－80℃，一兩年沒有問題,。zui關(guān)鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細(xì)菌消化掉(也是被酶水解了),。
Q: 如果上樣量超載,，要用什么方法來增加上樣量？如果需要加大上樣量使原來弱的條帶能看清楚,。
A：可以濃縮樣品,，也可以根據(jù)你的目標(biāo)分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地,，超載30％是不會有問題的,。如果已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要,，可以考慮加大膠的厚度,，可以試試1.5mm厚度的凝膠。
Q: 接下來我準(zhǔn)備采用DAB顯色技術(shù),，二抗是生物素化的多克隆抗體,，三抗是親和素生物素體系，不知采用這樣的方案后,，封閉液是否要作調(diào)整,，能否再用5％的脫脂奶粉呢？好像有資料說脫脂奶粉會影響親和素生物素的生成,，是嗎,？
A：不能使用脫脂奶粉，因為脫脂奶粉中含生物素,，用BSA代替應(yīng)該好一點(diǎn),，此外如果用于磷酸化指標(biāo)蛋白的檢測時也不能用脫脂奶粉，因為脫脂奶粉中含有酪蛋白,。
Q：一般一次上樣的蛋白總量是多少,，跟目的蛋白的表達(dá)量有關(guān)系嗎,？
A：Western Blot一般上樣30－100微克不等，結(jié)果跟目的蛋白的豐度,、上樣量,、一二抗的量和孵育時間都有關(guān)系，也與顯色時間長短有關(guān),。開始摸條件時,，為了拿到陽性結(jié)果，各個步驟都可以量多一點(diǎn)時間長一點(diǎn),，當(dāng)然背景也就出來了,。要拿到好的結(jié)果，如果抗體好的話比較容易,，抗體不好的話就需要反復(fù)地試了,，當(dāng)然有的不適合Western Blot的怎樣做也不行。所以拿到好的結(jié)果不容易,。
Q: 做組織樣品的western的時候,，處理樣品有什么訣竅嗎？還有,，您用過大牛血清做封閉劑嗎,？濃度如何？效果是不是比BSA好一點(diǎn),？
A：組織樣品必須進(jìn)行研磨,、勻漿超聲處理，蛋白質(zhì)溶解度會更好,，離心要充分,，膜蛋白需用更劇烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心),。還有一點(diǎn)就是組織中的蛋白酶活性更強(qiáng),，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入PMSF和蛋白酶抑制劑 cocktail），封閉劑一般5%脫脂奶粉較常用,。如果一抗為多克隆抗體,，使用BSA也是不錯的選擇。
Q: 大分子量蛋白200 kD,，在做western要注意什么呢,？
A：做200kd蛋白的Western Blot時要注意，分離膠建議選擇>7%的,；剝膠時要小心,；轉(zhuǎn)移時間需要相應(yīng)延長；要做分子量參照（否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析）,。
Q：蛋白的上樣量有沒有什么具體的要求,？
A：上樣量要根據(jù)實驗的要求來定,， 如果要求是定量和半定量的Western Blot 則上樣量要均等， 如果只是要定性,，則沒有太大的關(guān)系,， 盡量多上就行了， 但是不要超過0.3μg/mm2,。
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