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Western Blot(WB)實(shí)驗(yàn)詳解

閱讀:6264      發(fā)布時(shí)間:2018-4-24
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Western免疫印跡(Western Blot)是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上,然后利用抗體進(jìn)行檢測(cè),。對(duì)已知表達(dá)蛋白,,可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測(cè),對(duì)新基因的表達(dá)產(chǎn)物,,可通過(guò)融合部分的抗體檢測(cè),。我們將通過(guò)以下幾個(gè)方面來(lái)詳細(xì)地介紹一下Western Blot技術(shù):

【原理】

與 Southern或Northern雜交方法類似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳,,被檢測(cè)物是蛋白質(zhì),,“探針”是抗體,“顯色”用標(biāo)記的二抗,。經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品,,轉(zhuǎn)移到固相載體(例如PVDF膜)上,固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì),。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原,,與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng),再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng),,經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分,。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。

【分類】

western顯色的方法主要有以下幾種:

     i. 放射自顯影                        ii. 底物化學(xué)發(fā)光ECL                        iii. 底物熒光ECF                       iv. 底物DAB呈色

現(xiàn)在常用的有底物化學(xué)發(fā)光ECL和底物DAB呈色,,目前發(fā)表文章通常是用底物化學(xué)發(fā)光ECL,。只要買現(xiàn)成的試劑盒就行,操作也比較簡(jiǎn)單,,原理如下(二抗用HRP標(biāo)記):反應(yīng)底物為過(guò)氧化物+魯米諾,,如遇到HRP,即發(fā)光,,可使膠片曝光,,就可洗出條帶。

【主要試劑】

30%丙烯酰胺混合液,,1.5M Tris(pH 8.8),,1.0M Tris(pH 6.8),10%SDS,10%過(guò)硫酸銨(APS),,N,N,N',N'四甲基二乙胺(TEMED)等,。

【主要步驟】

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