封閉的原理：
固相載體表面(如elisa板,，NC膜或者PVDF膜上等)有很多孔洞，通過電轉(zhuǎn)或包被,，膠上的蛋白被轉(zhuǎn)移到了膜上,，或抗原/抗體固定在板上，蛋白以機(jī)械填補(bǔ)(堆積)和吸附的方式結(jié)合于表面,。
蛋白塞進(jìn)了表面的很多孔洞里面,，但蛋白并不是連續(xù)的，有很多空隙,，而且比如說樣品孔之間也有空隙,，這些孔洞并沒有填進(jìn)東西，而抗體也是蛋白，也會(huì)被吸附在空的洞里,，這樣就會(huì)有很多非特異性的信號(hào),。
封閉液中的蛋白可以與表面上的空白空洞位置結(jié)合，同樣以機(jī)械填補(bǔ)(堆積)和吸附覆蓋的方式結(jié)合在膜上,，因?yàn)橛?ldquo;填補(bǔ)”和“覆蓋”蛋白結(jié)合位點(diǎn)以避免一抗的非特異結(jié)合,，所以有“封閉”的說法。同樣這兩種作用使封閉液中的蛋白能夠很牢固的結(jié)合在空白位置上,。這樣抗體蛋白就不會(huì)被非特異性的吸附到膜上,，而只會(huì)跟特異性蛋白結(jié)合。
封閉劑應(yīng)封閉所有的未結(jié)合位點(diǎn)而不替換表面上的靶蛋白,、不結(jié)合靶蛋白表位,、也不與抗體或檢測(cè)試劑有交叉反應(yīng)。
封閉的目的
避免高背景和非特異性條帶
封閉所用試劑的選擇：
zui常見的封閉劑是：BSA（牛血清白蛋白）,、脫脂奶粉,、酪蛋白、明膠和Tween-20(0.05 - 0.1%)稀溶液PBST或者TBST,。
1,、 BSA
BSA是zui常用的封閉劑，成分單一適用于大多數(shù)情況,。若免疫原是偶聯(lián)BSA的,， BSA有很強(qiáng)的免疫原性，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生很多的針對(duì)BSA的抗體,，為避免交叉反應(yīng),，不能用BSA、脫脂奶粉等封閉,，可以選用酪蛋白或無蛋白的封閉劑封閉,。
大部分BSA中有少量的抗體殘留，會(huì)導(dǎo)致抗原/抗體之間的交叉反應(yīng),，產(chǎn)生高背景,，雜帶較多或使得本底水平增高。
2,、 血清
封閉血清的原理主要有兩點(diǎn),，*是待檢樣本會(huì)有些與蛋白非特異性結(jié)合的物質(zhì)，從而導(dǎo)致背景過高,，因此可以用BSA或血清封閉掉這部分非特異性的結(jié)合,，從這點(diǎn)看，BSA和血清沒有明顯區(qū)別,。第二是待檢樣本中可能會(huì)有Fc受體,，可以和抗體恒定區(qū)結(jié)合，與抗體特異性無關(guān)，封閉血清中有抗體，因此用血清可以封閉掉一抗及二抗和樣本Fc受體之間結(jié)合,。BSA則無法封閉Fc受體。
免疫組化中用血清封閉的較多。封閉血清一般選擇和二抗同一來源的，血清中動(dòng)物自身的抗體，預(yù)先能和組織中有交叉反應(yīng)的位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合,，否則在后面的步驟中如果和二抗發(fā)生結(jié)合,， 會(huì)造成背景。但要注意封閉用血清中不能含有目標(biāo)蛋白,，且與一抗來源不同,。另外二抗因盡量少選取兔子或老鼠來源的，因?yàn)檫@兩個(gè)在親緣關(guān)系上和人類非常接近,，所以產(chǎn)生交叉反應(yīng)的機(jī)會(huì)就比較大,，從而導(dǎo)致背景比較高。適合選用來源于驢,，山羊,，綿羊等的二抗，背景相對(duì)就很低,。
3,、 脫脂奶粉
脫脂奶粉zui大的優(yōu)點(diǎn)是價(jià)錢便宜，所以是,，但是由于成分相對(duì)復(fù)雜,，所以適用范圍要狹窄一些。磷酸化抗體也許會(huì)導(dǎo)致背景增加,，此外,，因?yàn)樽陨砗猩锼?不能用于生物素標(biāo)記的抗體系統(tǒng)。
奶粉蛋白種類比BSA多,，而WB膜也好,，ELISA板也好，表面的微結(jié)構(gòu)都不是那么均勻的,，相對(duì)而言,，不同分子量蛋白種類多的奶粉(BSA只是一種蛋白)，封閉起來更全面,。
脫脂奶粉中含有少量的生物素和堿性磷酸酶殘留,，在使用生物素-親和素系統(tǒng)和堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗時(shí)，也會(huì)使得高背景或本底水平增高,。
由于奶粉的成份復(fù)雜,，而且封閉后的載體不易長(zhǎng)期保存,，因此在試劑盒的制備中較少應(yīng)用。
4,、 酪蛋白
和BSA作用類似,，普通酪蛋白不易溶解。中性和堿性條件下帶有負(fù)電性,，與同樣帶負(fù)電荷膠體金之間存在排斥力,，而膜一般都是帶正電荷，會(huì)與酪蛋白有一定的吸附作用,，用酪蛋白封閉效果好些,。
5、 無蛋白化合物
甲醛：與PVDF膜表面的微結(jié)構(gòu)反應(yīng)或者結(jié)合,，使之失去結(jié)合蛋白的疏水力或者空間結(jié)構(gòu)域,。
去污劑(吐溫-20)：Tween-20是一種非離子型去污劑，有復(fù)性抗原的作用,，與膜疏水性吸附,，有很強(qiáng)的對(duì)非特異性吸附的洗脫作用，同樣可以降低蛋白間的疏水作用,，可提高特異性的識(shí)別能力,。在做westen blot時(shí)，用惰性蛋白質(zhì)或非離子去污劑封閉膜上的未結(jié)合位點(diǎn)可以降低抗體的非特異性結(jié)合,。Tween 這種非離子型去污劑在乳化蛋白時(shí),，不破壞蛋白的結(jié)構(gòu)，可減少對(duì)蛋白質(zhì)之間原有的相互作用的破壞,。離子型去污劑如SDS則破壞蛋白的結(jié)構(gòu),。
還有明膠，PEG等也可作為封閉劑,。
封閉劑選擇的特殊情況：
1.脫脂奶粉不能與生物素化或伴刀豆蛋白標(biāo)記的抗體一起使用,，因?yàn)槊撝谭酆刑堑鞍缀蜕锼亍?/span>
2.如果封閉劑中含磷酸酶，用磷酸化特異性抗體分析磷酸化蛋白受到影響,，因?yàn)榱姿崦概c印記膜上的磷酸化蛋白接觸可使之去磷酸化,。
3.檢測(cè)磷酸化抗體時(shí)，不能使用酪蛋白/脫脂奶粉作為封閉劑,。
一般封閉條件為：
室溫或者 37℃緩慢搖蕩1～2 h,，特殊情況也可 4℃過夜。根據(jù)結(jié)果情況調(diào)整封閉試劑的濃度和類型,。比如脫脂奶粉的封閉效果更強(qiáng),，但有時(shí) BSA 比脫脂奶粉更有利于降低非特異性背景，而有些抗體則在脫脂奶粉封閉的情況下才能得到清晰的背景,。
| 貨號(hào) | 產(chǎn)品 | 規(guī)格 |
| abs47014957 | Skim Milk（脫脂奶粉） | 100g/500g |
| abs49001012 | BSA (牛血清白蛋白) | 50g/100g |
| abs933 | Goat serum(山羊血清) | 10ml/50ml |
| abs936b | Horse serum(馬血清) | 200ml |
| abs935 | The ass serum(驢血清) | 10ml/50ml |
| abs42018941 | Gelatin（明膠） | 100g |
| abs42018942 | Gelatin（明膠） | 500g |
| abs42028945 | Tween-20 | 500 ml |
| abs42156574 | TBST 1 L of 20X | 1L |
愛必信特色產(chǎn)品線：
生化試劑（60萬種）,、抗體（10萬種）,、細(xì)胞因子、二抗,、ECL發(fā)光液,、蛋白marker、激動(dòng)劑,、抑制劑,、凋亡試劑盒、BSA,、動(dòng)植物提取物,、蛋白酶K...
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